SISTEMA DE CLASIFICACION E INMOVILIZACION PARA ACIDOS NUCLEICOS UTILIZANDO SISTEMAS DE FIJACION SINTETICOS.

Un método para modificar enzimáticamente un ácido nucleico diana,

por reacción de ligación independiente del molde, o ligación de extremos romos o por PCR, en donde un conjugado que comprende un ácido nucleico (NA) constituido por 1 a 5 nucleótidos para reacciones de ligación independientes del molde, en donde el NA del conjugado y el ácido nucleico adicional son monocatenarios, o para reacciones de ligación con extremos romos, en donde el NA del conjugado y el ácido nucleico adicional son bicatenarios, y en donde el NA del conjugado se modifica por ligación de un término del NA a al menos un ácido nucleico adicional, o 10 a 40 nucleótidos para PCR y al menos una unidad sintética de fijación (SBU) seleccionada del grupo constituido por p-RNAs y p-DNAs, y en donde la SBU está enlazada covalentemente por su extremo 2' con el extremo 5' del ácido nucleico (NA) o por su extremo 2' con el extremo 3' del ácido nucleico (NA) o por su extremo 4' con el extremo 3' del ácido nucleico NA o por su extremo 4' con el extremo 5' del ácido nucleico (NA), utilizando el ácido nucleico del conjugado como sustrato, comprendiendo el método:

a)poner en contacto el conjugado con al menos una enzima seleccionada del grupo constituido por una polimerasa, y una ligasa que utiliza los ácidos nucleicos existentes naturalmente como sustrato, y con otros reactivos necesarios para la acción de la enzima; y

b)incubar la mezcla obtenida en a) en condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima durante un periodo de tiempo suficiente para efectuar la modificación del ácido nucleico

Sistema de clasificación e inmovilización para ácidos nucleicos utilizando sistemas de fijación sintéticos.

La presente invención se refiere al uso de conjugados de unidades sintéticas de fijación y ácidos nucleicos como sustratos para reacciones enzimáticas independientes del molde, o fijación de extremos romos o de cadena de polimerasa, que incluyen reacciones de amplificación de ácidos nucleicos.

Las químicas y los análisis de ácidos nucleicos han ascendido hasta un lugar de prominencia en áreas tan diversas como la investigación biológica, la medicina, la agricultura, e incluso la ciencia forense. Una necesidad fundamental en el uso de ácidos nucleicos en todas estas áreas es la posibilidad de manipular los mismos en una escala macroscópica por localización de especies (o grupos de especies) particulares de ácido nucleico en una localización conocida, por ejemplo en una red sobre un sustrato. Con objeto de inmovilizar los ácidos nucleicos sobre materiales soporte, se ha ideado una amplia gama de métodos, que pueden clasificarse en términos generales por la estabilidad del enlace. Una inmovilización covalente, es decir una inmovilización en la cual el ácido nucleico está enlazado a estructuras moleculares del material soporte por uniones covalentes, es típicamente irreversible sin riesgo de la degradación del ácido nucleico inmovilizado. En cambio, pueden utilizarse reacciones complejantes, o reacciones entre dos socios de un sistema de unión que se reconocen específicamente uno a otro. Estas reacciones pueden ser reversibles o, para propósitos prácticos, irreversibles a lo largo de la escala de tiempo de un experimento particular. Si un sistema de unión para inmovilización de ácidos nucleicos debe designarse reversible o irreversible depende finalmente de la posición del equilibrio entre los ácidos nucleicos fijados y libres. Un ejemplo de un sistema de fijación que debe considerarse como prácticamente irreversible es la complejación de biotina por avidina (o estreptavidina, o sus diversas proteínas equivalentes modificadas genéticamente), con una constante de fijación de K_a approx 2,5 x 10¹³ (M^-1) (Chilkoti, A.; Stayton, P.A.; J. Am. Chem. Soc. 117, 10622-10628 (1995); Greene M.; Advances in Protein Chemistry; 85-132 (1975)). Este sistema ha sido ampliamente utilizado para inmovilización de ácidos nucleicos y otras biomoléculas sobre materiales soporte.

WO86/07387 describe un ejemplo diferente de unión reversible de ácidos nucleicos a superficies. Como se describe en este documento, las secuencias de fijación de ácido nucleico se inmovilizan sobre materiales soporte por medio de agentes complejantes, por ejemplo con ayuda de pares anticuerpo/antígeno.

Otro ejemplo de un sistema de apareamiento reversible que ha sido utilizado son juegos de oligómeros de nucleótidos naturales, que se hibridan específicamente para proporcionar "identificadores" de formación de dúplex para inmovilización. En contraste con biotina-estreptavidina, los oligómeros de ácido nucleico tienen una dimensionalidad informática en la formación de pares: existen una multiplicidad de juegos de fijación específicos que pueden idearse, caracterizados por la secuencia de monómeros (nucleótidos) que se aparean específicamente sólo con secuencias complementarias. Al contrario que los sistemas multi-hapteno-lectina, o los sistemas multi-anticuerpo-antígeno, tales juegos de identificadores de ácido nucleico tienen características químicas y termodinámicas aceptablemente uniformes, lo que facilita su uso en reacciones múltiples.

EP 0305145 describe, por ejemplo, el uso de colas de homopolinucleótidos y su apareamiento específico con oligómeros de homopolinucleótidos complementarios para inmovilización de oligonucleótidos específicos de diana. Por otra parte, JP 03151900 describe el uso de secuencias específicas de ácido nucleico para inmovilización de ácidos nucleicos específicos de diana. Es característico de tales sistemas que el oligonucleótido a inmovilizar se componga de dos partes: una parte oligómera complementaria al oligonucleótido inmovilizado en la superficie del soporte, y una segunda parte oligómera específica para interacción con componentes de la muestra (v.g., complementaria a un ácido nucleico muestra). Sistemas similares se describen también en WO93/13225, WO93/13223, WO93/25563, US 5 763 175, WO97/32999, WO00/58516 y en WO00/60124.

La desventaja de los métodos arriba descritos es que la secuencia utilizada para la inmovilización puede hibridarse potencialmente con la secuencia a inmovilizar, formando estructuras secundarias intramoleculares, puede hibridarse con otra secuencia a inmovilizar, formando estructuras secundarias intermoleculares, o puede hibridarse con los ácidos nucleicos de la muestra. El riesgo de una interacción indeseable o interferente de este tipo aumenta con la longitud del o de los ácidos nucleicos a inmovilizar y con la complejidad de una muestra (v.g., la posibilidad de ácidos nucleicos contaminantes de organismos desconocidos).

Otra desventaja del uso de ácidos nucleicos naturales para inmovilización es que la estabilidad de los dúplex de ácidos nucleicos naturales no aumenta linealmente en proporción a la longitud (número de nucleótidos en la secuencia) a lo largo de un intervalo amplio, sino que se aproxima más bien a un límite que depende únicamente del porcentaje relativo de pares de bases CG a AT ("contenido de CG"). Sistemas de fijación que tienen una estabilidad de dúplex que excede del límite natural no pueden prepararse utilizando ácidos nucleicos naturales. Esta limitación es también problemática cuando se aplican diversas condiciones de severidad al ácido nucleico en su localización inmovilizada: Los identificadores de ácido nucleico inmovilizantes se verán sometidos también a las mismas condiciones de severidad (es decir, agentes caotrópicos, condiciones térmicas, o fuerzas electrostáticas) y pueden disociarse. Véase G. Michael Blackbum y Michael J. Gait, eds. Nucieic Acids in Chemistry and Biology, 2ª edición, 1996, Oxford University Press, Nueva York.

La consecución de una diferenciación fina en diferenciación de severidad entre interacciones de identificadores de inmovilización (que deben permanecer hibridadas) y las interacciones específicas de la diana (que a menudo se discriminan al nivel de desapareamiento de un solo par de bases) es a menudo difícil, especialmente en condiciones de tipo clínico cuando el método debe ser particularmente robusto y consistente.

Otra desventaja significativa económica y de tiempo del uso de ácidos nucleicos naturales como agentes de inmovilización es que se requiere una cierta longitud mínima de secuencia para alcanzar un nivel práctico de estabilidad y selectividad de la inmovilización. Es típico utilizar 20-meros a fin de conseguir una especificidad de fijación suficiente. Esto da como resultado que la cadena de ácido nucleico entera (compuesta de la secuencia para el reconocimiento de la muestra y la secuencia para inmovilización) resulte relativamente larga. El uso de secuencias muy largas puede ser desventajoso por varias razones. En primer lugar, el uso de secuencias largas de ácido nucleico aumenta la probabilidad de formación intramolecular de estructuras secundarias, y aumenta también la probabilidad de hibridación transitoria o estable entre cadenas múltiples en solución.

Se han descrito dispositivos de redes electrónicas activas para el transporte electroforético y la manipulación de ácidos nucleicos, véanse las Patentes U.S. núms. 6.245.508; 6.225.059; 6.051.380; y 6.017.696, el texto de cada una de las cuales se incorpora por la presente por referencia en su totalidad. Cuando se manipulan ácidos nucleicos en redes electrónicas activas, se prefiere el uso de secuencias más cortas. El direccionamiento electrocinético y el movimiento en la red de chips electrónicos funcionan particularmente bien con ácidos nucleicos relativamente cortos debido a la mejor movilidad electroforética de las moléculas más pequeñas. Así, las secuencias más cortas para uso como agentes de complejación con inmovilización tienen mayor utilidad en el contexto de las redes electrónicas activas.

Otra desventaja de la utilización de sistemas naturales para la inmovilización de ácidos nucleicos es que tales sistemas pueden degradarse o destruirse fácilmente durante su uso. En particular, la degradación por componentes enzimáticos de la muestra, o incluso DNAsas y RNAsas contaminantes de las yemas de los dedos de los operarios del laboratorio, constituyen un problema. La degradación...

1. Un método para modificar enzimáticamente un ácido nucleico diana, por reacción de ligación independiente del molde, o ligación de extremos romos o por PCR, en donde un conjugado que comprende un ácido nucleico (NA) constituido por 1 a 5 nucleótidos para reacciones de ligación independientes del molde, en donde el NA del conjugado y el ácido nucleico adicional son monocatenarios, o para reacciones de ligación con extremos romos, en donde el NA del conjugado y el ácido nucleico adicional son bicatenarios, y en donde el NA del conjugado se modifica por ligación de un término del NA a al menos un ácido nucleico adicional, o 10 a 40 nucleótidos para PCR y al menos una unidad sintética de fijación (SBU) seleccionada del grupo constituido por p-RNAs y p-DNAs, y en donde la SBU está enlazada covalentemente por su extremo 2' con el extremo 5' del ácido nucleico (NA) o por su extremo 2' con el extremo 3' del ácido nucleico (NA) o por su extremo 4' con el extremo 3' del ácido nucleico NA o por su extremo 4' con el extremo 5' del ácido nucleico (NA), utilizando el ácido nucleico del conjugado como sustrato, comprendiendo el método:

2. El método de la reivindicación 1, en donde la ligasa utilizada es una RNA-ligasa T4.

3. El método de la reivindicación 1 en donde la enzima es una polimerasa, en donde el NA del conjugado tiene un extremo 3' no bloqueado, en donde los otros reactivos comprenden un ácido nucleico molde al cual se hibrida el término 3' no bloqueado del NA, y en donde el NA se modifica por la adición de al menos un nucleósido complementario al ácido nucleico molde al término 3' del NA.

4. El método de la reivindicación 3 en donde se añade un didesoxinucleótido al NA del conjugado.

5. El método de la reivindicación 3 ó 4 en donde se añade un nucleótido marcado al NA del conjugado.

6. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 5, en donde el ácido nucleico molde se deriva de una muestra biológica.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la muestra biológica se deriva de una muestra seleccionada del grupo constituido por materiales humanos, materiales animales, materiales de plantas, materiales fúngicos, cultivos de células, cultivos de virus, muestras de alimentos, y muestras de agua.

8. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 7, en donde la polimerasa es al menos una enzima seleccionada del grupo constituido por DNA-polimerasas, RNA-polimerasas, y transcriptasas inversas.

9. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 8, en donde se amplifica al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico molde.

10. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 9 en donde la polimerasa es una polimerasa termoestable, y en donde las condiciones de b) comprenden someter a termociclación la mezcla de a) para alternativamente i) disociar los productos de extensión del ácido nucleico molde y ii) permitir la hibridación del NA conjugado al molde y la extensión enzimática del NA del conjugado, en donde se amplifica al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico molde.

11. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 10, en donde la polimerasa es una mezcla de una RNA-polimerasa y una transcriptasa inversa, que comprende adicionalmente poner en contacto el conjugado con una actividad de RNAsa H en la mezcla de a), en donde se amplifica al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico molde por amplificación mediada por transcripción.

12. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11 en donde el ácido nucleico (NA) se selecciona del grupo constituido por ácidos desoxirribonucleicos, ácidos ribonucleicos, ácidos nucleicos químicamente modificados, ácidos nucleicos de fosforotioato, ácidos nucleicos de fosforoditioato, ácidos nucleicos de metilfosfonato, 2'-O-metil-RNA, 2'-fluoro-RNA, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos inmovilizados (LNA), un aptámero y una aptazima.

13. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el conjugado comprende adicionalmente al menos un resto de marcación.

14. El método de la reivindicación 13, en donde el resto de marcación se selecciona del grupo constituido por restos fluorescentes, restos de extinción, restos de tinte visibles, restos radiactivos, restos quimioluminiscentes, restos de biotina, restos de hapteno, micropartículas, micropartículas paramagnéticas, y restos enzimáticos de marcación.

15. El método de la reivindicación 13, en donde el resto de marcación es un resto de tinte fluorescente seleccionado del grupo constituido por: tintes BODIPY^TM, tintes de cianina, tintes Alexa^TM, tintes de fluoresceína, tintes de rodamina, tintes de ficoeritrina, tintes de cumarina, tintes Rojo Texas, Lissamine^TM, FAM, HEX, TET, TAMRA, ROX, EDANA, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianato-estilbeno-2,2'-disulfónico, ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, pireno-butirato de succinimidilo, isotiocianato de acridina, Azul Cascada, Verde Oregón, Amarillo Lucifer-vinilsulfona, e IR1446 (Tinte Láser Kodak^TM).

16. El método de la reivindicación 13, en donde el resto de marcación es un resto de extinción seleccionado del grupo constituido por restos Black Hole Quencher^TM, DABCYL, Rojo Reactivo 4 (Rojo Brillante Cibacron 3B-A), Verde Malaquita, 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC), y restos de ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico.