Vacunas en forma de ADNi y métodos para utilizarlas.

Un vector plasmídico que contiene:

(a) un promotor de la ARN polimerasa,

ligado operablemente a un ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso; y

(b) una cola de poli-A en dirección 3' respecto a dicho ADN

donde:

(i) la molécula de ARN codifica un virus de la fiebre amarilla (YF) atenuado; y

(ii) el promotor de la ARN polimerasa es adecuado para la expresión en células de mamífero.

Vacunas en forma de ADNi y métodos para utilizarlas CAMPO DE LA INVENCION

Varias realizaciones descritas en la presente se refieren a vacunas víricas atenuadas vivas y sistemas y métodos para producir y administrar tales vacunas.

ANTECEDENTES

En la siguiente discusión, se hace referencia a ciertas estructuras y/o métodos. Sin embargo, las siguientes referencias no se deben interpretar como una admisión de que esas estructuras y/o métodos constituyen la técnica anterior. Los solicitantes se reservan expresamente el derecho de demostrar que tales estructuras y/o métodos no se consideran la técnica anterior.

Muchos virus con ARN, incluidos el virus de la fiebre amarilla (YF, por sus siglas en inglés), el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE, por sus siglas en inglés) son peligrosos patógenos humanos. VEE es un patógeno con prioridad de la categoría B e YF es un patógeno con prioridad de la categoría C, según la clasificación de NIH/NIAID.

El virus VEE es un arbovirus con ARN monocatenario positivo que pertenece al género Alphavirus de la familia Togavirídae. El virus se transmite principalmente mediante los mosquitos, que pican a un animal infectado y posteriormente pican a otro animal o ser humano y se alimentan de este. El VEE es raro en los EE. UU. En Texas tuvo lugar una epizootia en caballos importante, pero tan solo se han documentado aproximadamente 1 casos confirmados por laboratorio en seres humanos. Sin embargo, el cambio climático puede favorecer el establecimiento del virus en áreas más cálidas de los EE. UU. Además, el VEE es un arma biológica y un agente de bioterrorismo potencial.

El virus YF también es un arbovirus con ARN monocatenario positivo. Sin embargo, a diferencia del VEE, el virus YF pertenece a la familia Flaviviridae. La enfermedad de YF ocurre principalmente en África y Sudamérica. La infección en seres humanos comienza tras el depósito de partículas víricas por parte de un mosquito infectado a través de la piel. A menudo la enfermedad es grave. Pueden ocurrir casos más moderados como resultado de una infección previa por parte de otro flavivirus. Existe una diferencia entre brotes de la enfermedad en áreas rurales o forestales y en áreas urbanas (Barnett, 27). Los brotes de la enfermedad en pueblos y con gente no nativa pueden ser más serios debido a unas densidades de los mosquitos vectores más elevadas y densidades de población más elevadas. Con fecha de 21, la Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que el virus YF causa 2 manifestaciones clínicas y 3 fallecimientos cada año en las poblaciones no vacunadas. En la mayoría de los casos, los pacientes con YF requieren un tratamiento sintomático. En los casos graves se utilizan la reposición de fluidos, transfusión de derivados sanguíneos y otras medidas.

Se han desarrollado virus atenuados vivos para su utilización como vacunas con muchos virus con ARN tales como los virus VEE, YF, de la poliomielitis, de la gripe, del sarampión, de la rabia y de la rubéola. Las vacunas con virus con ARN atenuados vivos tradicionales comprenden virus con ARN atenuados vivos que se inyectan en el receptor de la vacuna. El virus inyectado suministra su genoma de ARN al interior de las células, lo que da lugar a la producción de antígenos víricos así como también de una progenie de virus atenuados en los tejidos del receptor de la vacuna. Esto conlleva la generación de una respuesta inmunitaria que protege contra los virus no atenuados homólogos.

La técnica anterior incluye el artículo J. Experimental Medicine, 23(2), 413-424, 26, que divulga una vacuna contra el virus de la fiebre amarilla basada en la cepa YF17D atenuada viva.

COMPENDIO

La materia en cuestión para la que se busca protección es tal y como se define en las reivindicaciones. En particular, la presente invención proporciona un vector plasmídico que comprende:

(a) un promotor de la ARN polimerasa, ligado operablemente a un ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso; y

(b) una cola de poli-A en dirección 3 respecto a dicho ADN donde:

(i) la molécula de ARN codifica un virus de la fiebre amarilla (YF) atenuado; y

(¡i) el promotor de la ARN pollmerasa es adecuado para la expresión en células de mamífero.

Esta solicitud proporciona vectores que comprenden ADN que codifica una molécula de ARN Infeccioso y un promotor de la ARN polimerasa, donde el ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso está ligado operablemente al promotor de la ARN pollmerasa y la molécula de ARN Infeccioso codifica un virus de la fiebre amarilla (YF). En ciertas realizaciones, el virus YF no es patógeno. También se describen vacunas contra la fiebre amarilla (YF) que comprenden los vectores descritos anteriormente y los métodos para utilizar las vacunas para Inmunizar contra un virus de YF. También se divulgan virus atenuados vivos purificados clonalmente homogéneos preparados a partir de células cultivadas transfectadas con el vector, vacunas contra YF que los comprenden y métodos para utilizar las vacunas para Inmunizar contra un virus YF.

Aunque no es parte de la invención reivindicada, esta solicitud divulga vectores que comprenden ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso y un promotor de la ARN polimerasa, donde el ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso está ligado operablemente al promotor de la ARN polimerasa y la molécula de ARN Infeccioso codifica un virus de la encefalitis equina venezolana (VEE). El virus de la VEE podrá no ser patógeno. También se describen vacunas contra la encefalitis equina venezolana (VEE) que comprenden los vectores descritos anteriormente y métodos para utilizar las vacunas para Inmunizar contra un virus VEE. También se describen virus atenuados vivos purificados clonalmente homogéneos preparados a partir de células cultivadas transfectadas con el vector, vacunas contra VEE que los comprenden y métodos para utilizar las vacunas para inmunizar contra un virus VEE.

Aunque no es parte de la invención reivindicada, esta solicitud divulga vectores que comprenden un ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso y un promotor de la ARN polimerasa de citomegalovirus (CMV), donde el ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso está ligada operablemente al promotor de la ARN polimerasa de CMV, el promotor de la ARN polimerasa de CMV está ubicado entre aproximadamente 12 y aproximadamente 18 residuos de ácido nucleico en dirección 5 respecto al extremo 5 de dicho ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso, y la molécula de ARN infeccioso codifica un virus con ARN atenuado. El virus con ARN atenuado podrá ser un alfavlrus o un flavivirus.

Aunque no es parte de la invención reivindicada, esta solicitud divulga métodos para atenuar un virus con ARN, que comprende Insertar dos promotores de ARN dependientes de ARN en el ADNc que codifica el virus con ARN, con lo que la nucleocápside y las glucoproteínas se expresan por separado a partir de promotores independientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Representación esquemática de vacunas TC-83 contra VEE basadas en un ADNi. (A) El ADNc completo que corresponde al genoma de ARN de TC-83 se clona en el ADN que contiene un promotor de la ARN polimerasa dependiente de ADN, por ejemplo, un promotor CMV. Se muestra la ubicación de las secuencias del promotor CMV, promotor 26S, poliA, terminación de la transcripción y ribozima (opcional). (B) Ejemplo de la vacuna con TC-83 basadas en ADNi, en la que se expresan los genes de la cápside y glucoproteína de TC-83 a partir de promotores independientes. Se muestra la ubicación de los promotores. Se puede modificar el sitio de Inicio de la transcripción variando la distancia entre el extremo 3 del promotor CMV y el extremo 5 de la secuencia codificante de TC-83.

Figura 2. Administración de la vacuna en forma de ADNi de TC-83 al interior de células in vitro o in vivo. Se muestra la inyección de la vacuna en forma de ADN de TC-83 controlado por promotor de la ARN polimerasa dependiente de ADN (remítase a la Figura 1) al interior de las células in vitro o in vivo. Como consecuencia de la administración de la vacuna en forma de ADNi de TC-83, se genera una vacuna TC-83 con un virus atenuado vivo. Si se administra in vivo, la producción de la vacuna TC-83 en los tejidos del paciente provoca una respuesta ¡nmunitaria contra la vacuna TC-83.

Figura 3. Representación esquemática de una vacuna con YF17D basada en ADNi. Se clona el ADNc completo correspondiente al genoma de ARN de 17D en el ADN que contiene el promotor de la polimerasa de ARN funcional, por ejemplo, el promotor CMV. Se muestran la ubicación de las secuencias de promotor CMV, poliA, terminación de la transcripción... [Seguir leyendo]

1. Un vector plasmídico que contiene:

(a) un promotor de la ARN polimerasa, ligado operablemente a un ADN que codifica una molécula de ARN

infeccioso; y

(b) una cola de poll-A en dirección 3 respecto a dicho ADN donde:

(i) la molécula de ARN codifica un virus de la fiebre amarilla (YF) atenuado; y

(¡I) el promotor de la ARN polimerasa es adecuado para la expresión en células de mamífero.

2. El vector de la reivindicación 1, donde el promotor está ubicado entre aproximadamente 12 y aproximadamente 18

nucleótidos en dirección 5 respecto al extremo 5 de dicho ADN.

3. El vector de la reivindicación 2, donde el promotor está ubicado 15 nucleótidos en dirección 5 respecto al extremo 5 de dicho ADN.

4. El vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la cola de poli-A está ubicada entre y 5 15 nucleótidos en dirección 3 respecto a dicho ADN.

5. El vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el promotor es un promotor de la ARN polimerasa de CMV.

6. El vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho ADN que codifica dicha molécula de ARN comprende un ADNc de YF17D (nucleótidos de 73 a 11564 de la Figura 8 o una secuencia polinucleotídica

que tiene una identidad secuenclal de al menos un 95% con dicho ADNc de YF17D a lo largo de la longitud completa de este último).

7. Una vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. La vacuna de la reivindicación 7 que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

9. La vacuna de la reivindicación 7 o la reivindicación 8 para su uso en la inmunización de un mamífero contra un

virus YF.

1. La vacuna para su uso tal y como se reivindica en la reivindicación 9, donde el mamífero es un ser humano.