Uso de la granulisina para el tratamiento de tumores sólidos.

Uso de la granulisina para el tratamiento de tumores sólidos.

La presente invención se refiere al uso de la granulisina o de una molécula de ácido núcleico que codifique para la granulisina,

para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor sólido canceroso, en el que la composición farmacéutica se administra localmente, más concretamente intratumoralmente. Adicionalmente, la presente invención se enfrenta al problema de producir cantidades suficientes de granulisina activa y correctamente plegada que permitan su uso como composición farmacéutica en mamíferos, preferiblemente en humanos.

DESCRIPCIÓN Uso de la granulisina para el tratamiento de tumores sólidos. 5 Campo técnico de la invención Esta invención pertenece al campo médico, más concretamente al uso de la granulisina o de una molécula de ácido núcleico que codifique para la granulisina, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor sólido canceroso. 10 Antecedentes de la invención La siguiente discusión de los antecedentes de la invención se proporciona simplemente para ayudar al lector a comprender la invención y no se reconoce que describa o constituya técnica 15 anterior de la presente invención. La granulisina es una proteína contenida en los gránulos de los linfocitos T citotóxicos y de las células NK que posee potencial citolítico sobre células tumorales aunque su función más relevante parece ser la lisis directa de bacterias intracelulares como M. tuberculosis. Los 20 autores de la presente invención han dedicado una gran cantidad de esfuerzos con el objetivo de dilucidar el mecanismo a través del cual la granulisina ejerce su acción antitumoral. En este sentido, han mostrado que dicho mecanismo de inducción de muerte en células tumorales depende de la activación de la vía apoptótica mitocondrial y, en especial del factor inductor de apoptosis (AIF) , pero no tanto de las caspasas, constituyendo un nuevo mecanismo en la 25 citotoxicidad inducida por las células efectoras del sistema inmune. El hecho de que el mecanismo de inducción de muerte sea diferente del mecanismo clásico de la apoptosis, dependiente de caspasas, hace que la granulisina pueda ser una alternativa a los tratamientos anti-tumorales convencionales. Así, la introducción directa de esta proteína o de 30 un gen que codifique para dicha proteína en células malignas in vivo o la introducción directa de esta proteína en la zona donde esté localizado el tumor, puede proporcionar un tratamiento efectivo de tumores localizados, tales como los túmores sólidos. En este sentido, varias modalidades de tratamientos similares utilizando otras proteínas o genes terapéuticos se han intentado hasta el momento. Por ejemplo, proporcionando genes normales supresores 35 tumorales y/o inhibidores de oncogenes activados en células tumorales; o bien, potenciando la inmunogenicidad de las células tumorales in vivo mediante la introducción de genes de citoquina; ó también, introduciendo genes que codifican enzimas capaces de conferir a las células tumorales sensibilidad a los agentes quimioterapéuticos. No obstante, la técnica anterior sigue mostrándose deficiente en la falta de una técnica terapéutica eficiente para el 40 tratamiento de tumores sólidos. Así, una posible técnica terapéutica eficiente para el tratamiento de tumores supondría la introducción de la granulisina directamente en un tumor localizado, tal y como un tumor sólido, ó directamente en las células tumorales de dicho tumor a través de la utilización de 45 herramientas de terapía génica. No obstante, podría ser que la granulisina, al ser inyectada de forma intratumoral produjera la destrucción de la epidermis, ya que se ha demostrado que la granulisina está implicada en el síndrome de Steven-Johnson, una reacción exacerbada del sistema inmunitario contra determinados fármacos o productos químicos, que produce, entre otras cosas, la muerte de los queratinocitos y la necrolisis de la epidermis (Chung, W.H., 50 Hung, S.I., Yang, J.Y., Su, S.C., Huang, S.P., Wei, C.Y., Chin, S.W., Chiou, C.C., Chu, S.C., Ho, H.C., et al. "Granulysin is a key mediator for disseminated keratinocyte death in Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis". Nature Med. 14: 1343, 2008) . Este hecho impediría la utilización de esta proteína como terapia antitumoral en tumores localizados, tales como los túmores sólidos. 5 Por lo tanto, así, el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar medios para un tratamiento eficaz de los tumores sólidos cancerosos. Breve descripción de la invención 10 La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar medios para un tratamiento eficaz de los tumores sólidos cancerosos, resolviendo dicho problema a través del uso de la granulisina o de una molécula de ácido núcleico que codifique para la granulisina, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un tumor sólido canceroso, en el que la composición farmacéutica se administra localmente, más 15 concretamente intratumoralmente. Adicionalmente, la presente invención se enfrenta al problema de producir cantidades suficientes de granulisina activa y correctamente plegada que permitan su uso como composición farmacéutica en mamíferos, preferiblemente en humanos. 20 Asi, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método de producción de granulisina recombinante que comprende los siguientes pasos: a) Clonar un polinucleótido que codifica para el polipéptido granulisina en una molécula de ácido núcleico, donde dicha molécula comprende una secuencia de polihistidina que, tras el clonaje, queda unida al extremo N-terminal de la granulisina; 25 b) Tranformar o transducir bacterias competentes con la molécula de ácido nucleíco de la etapa a) ; c) Inducir la expresión de la granulisina en un medio de cultivo que comprenda las bacterias competentes transformadas o transducidas de la etapa b) ; d) Obtener el sobrenadante, trás la lisis celular, del medio de cultivo de la etapa c) y 30 adicionar dicho sobrenadante, o una alícuota de dicho sobrenadante, a una resina que comprenda un catión divalente unido a un agente quelante capaz de unirse a la secuencia de polihistidina del extremo N-terminal de la granulisina; e) Lavar la resina con una solución tampón desnaturalizante capaz de eliminar uniones inespecíficas; 35 f) Evitar agregaciones del polipéptido adicionando al producto de la etapa e) una solución tampón que comprenda un detergente capaz de evitar dichas agregaciones; g) Eliminar el detergente de la etapa f) con una solución tampón que comprenda metil--ciclodextrina; y h) Eluir el polipéptido de la resina con una solución tampón de lavado. 40 En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el polipéptido granulisina comprende o consiste en la SEQ ID No 1. En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, la solución tampón 45 desnaturalizante comprende cloruro de guanidinio (presentando un pH de aproximadamente 7.5) y la solución tampón de las etapas f) y g) comprende Tris-HCl y NaCl (presentando un pH de aproximadamente 8.0) . En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el detergente de la etapa f) es 50 Tritón X-100. Preferiblemente, el detergente de la etapa f es Tritón X-100, la solución tampón desnaturalizante comprende cloruro de guanidinio (presentando un pH de aproximadamente 7.5) y la solución tampón de las etapas f) y g) comprende Tris-HCl y NaCl (presentando un pH de aproximadamente 8.0) . En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el catión divalente es niquel 5 y esté está unido al agente quelante NiTA (Ácido Nitrilotriacético) . En aún otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el detergente de la etapa f) es Tritón X-100, la solución tampón desnaturalizante comprende cloruro de guanidinio, (presentando un pH de aproximadamente 7.5) ; la solución tampón de las etapas f) y g) 10 comprende Tris-HCl y NaCl (presentando un pH de aproximadamente 8.0) ; el catión divalente es niquel y esté está unido al agente quelante NiTA (Ácido Nitrilotriacético) y el polipéptido granulisina comprende o consiste en la SEQ ID No 1. En aún otra realización preferida del primer aspecto de invención, la molécula de ácido 15 nucleíco de la etapa a) es el plásmido pEt-28° (+) (ver figura 2) . En todavía otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el detergente de la etapa f) es Tritón X-100, la solución tampón desnaturalizante comprende cloruro de guanidinio (presentando un pH de aproximadamente 7.5) ; la solución tampón de las etapas f) 20 y g) comprende Tris-HCl y NaCl (presentando un pH de aproximadamente 8.0) ; el catión divalente es niquel y esté está unido al agente quelante NiTA (Ácido Nitrilotriacético) ; el polipéptido granulisina comprende o consiste en la SEQ ID No 1 y la molécula de ácido nucleíco de la etapa a) es el plásmido pEt-28° (+) (ver figura 2) . 25 Otra realización de la presente invención se refiere a la granulisina recombinante obtenible por el método del primer aspecto de la invención. Un segundo aspecto de la invención, se refiere a una composición que comprende granulisina, ó sales farmacéuticamente aceptables de este compuesto, para su uso en el tratamiento de un 30 tumor sólido canceroso, donde la composición se... 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