TRANSCRIPTASA INVERSA DE LA TELOMERASA AVIAR.

Polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia aminoácida que presenta por lo menos 80% de identidad de la secuencia aminoácida con la secuencia aminoácida SEC ID nº 1 de la transcriptasa inversa de la telomerasa de Cairina moschata y que presenta actividad TERT

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/050120.

Solicitante: TRANSGENE SA.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: PARC D'INNOVATION BOULEVARD GONTHIER D ANDERNACH 67400 ILLKIRCH GRAFFENSTADEN FRANCIA.

Inventor/es: BALLOUL, JEAN-MARC, ERBS, PHILIPPE, SILVESTRE, NATHALIE, KAPFER,MARINA.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 5 de Enero de 2007.

Fecha Concesión Europea: 11 de Agosto de 2010.

Clasificación PCT:

  • C12N9/12 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

TRANSCRIPTASA INVERSA DE LA TELOMERASA AVIAR.

Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere en particular a nuevas transcriptasas inversas de la telomerasa recombinantes, a las moléculas de ácidos nucleicos que las codifican, a las células que incluyen dicha molécula ácido nucleica, y a la utilización de estas células para la producción de sustancias de interés.

En 1965, L. Hayflick descubrió que las células tienen un momento programado para morir. Como una explicación para el envejecimiento, sugirió que el número de veces que una célula humana puede dividirse, es limitado (Exp Cell Res., marzo de 1965; 37: 614-36). Se sabe ahora que esto es causado por el acortamiento de los telómeros cuando las células se dividen. Los cromosomas finalizan por telómeros constituidos por secuencias hexaméricas, no codificantes, repetidas en tándem y conservadas de ADN, asociadas a proteínas de unión únicas y bicatenarias. Los telómeros son responsables de las funciones estables genómicas y en particular, de la replicación de los extremos cromosómicos. La replicación exitosa del extremo cromosómico depende tanto de la estructura única telomérica como de la transcriptasa inversa de la telomerasa enzimática especializada, que es una nucleoproteína que tiene una actividad enzimática transcriptasa inversa. La transcriptasa inversa de la telomerasa puede prolongar la formación repetitiva telomerásica, permitiendo la ampliación de la replicación de la cadena hermana complementaria. En las células que carecen de transcriptasa inversa de la telomerasa, el ADN telomérico se acorta en las divisiones sucesivas, ya que las enzimas de la síntesis del ADN no pueden replicar completamente el extremo cromosómico, una vez que se elimina el cebador del ARN inicial. En numerosos trabajos se ha informado de la evidencia de que el "reloj telomérico" constituye una característica importante de la duración de la vida de la célula humana. La hipótesis telomérica del envejecimiento celular propone que el acortamiento del telómero está relacionado con la falta de actividad transcriptasa, provocando la inestabilidad cromosómica, llevando a la senescencia, y a la apóptosis. La actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa está regulada por la disminución en las estirpes celulares somáticas durante el desarrollo in vivo y en las células primarias in vitro, correlacionándose con el acortamiento telomérico. Contrariamente a esto, la regulación por elevación o desregulación de la actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa tiene lugar en las células transformadas y en los tumores. Se clonaron y estudiaron los cADN de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) de diversos mamíferos y de un anfibio (Nakamura et al. 1997, Science 277, 955-959; Greenberg et al. 1998, Oncogene 16, 1723-1730).

Como la sobreexpresión de TERT en una célula conduce a la inmortalización de dicha célula, se ha propuesto la utilización de TERT para la producción de progenies celulares (McSharry et al., 2001, J Gen Virol, 82, 855-63). Sin embargo, la actividad de TERT está restringida a la especie. Por ejemplo, la TERT humana es incompatible con el aparato de mantenimiento del telómero aviar (Michailidis et al, 2005, Biochem Biophys Res Commun, 335 (1), 240-6). Por tanto, para desarrollar las progenies celulares aviares y más particularmente, las anátidas, es necesario un TERT que actúe en estas células particulares.

Delany et al (Delany ME, Daniels L.M., Gene, 15 de septiembre de 2004; 339:61-9) dan a conocer un polipéptido TERT aislado del pollo Gallus domesticus (es decir, chTERT), que pertenece a la familia de los Fasiánidos, así como la correspondiente secuencia ácido nucleica. Los autores enseñan que los polipéptidos TERT de los vertebrados (es decir, pollos, el hombre, Xenopus, rata, ratón y hámster) muestran conservación en regiones específicas. Sin embargo, los autores de este artículo no dan a conocer ni sugieren que la molécula ácido nucleica que codifica el polipéptido chTERT pueda utilizarse para la inmortalización de las células, siempre que se tenga la intención de producir virus o moléculas de interés. Delany et al nunca se refieren, incluso, al interés de clonar posteriormente proteínas TERT aviares.

Fragnet et al (Fragnet L, Kut E. Rasschaert D. J Biol Chem. 24 de junio de 2005; 280 (25):23502-15) constituye un artículo de revisión que se relaciona con la correlación entre virus y activación de la actividad telomerásica. Los autores mencionan que la actividad telomerásica puede estar asociada con la carcinogénesis, y presentan la actividad telomerásica como un factor entre muchos otros en el proceso multifactorial de la tumorigénesis, que implica la desregulación de la expresión de varias proteínas del ciclo celular y de los sistemas de reparación del ADN.

Las progenies celulares eucarióticas son fundamentales para la preparación de vacunas víricas y de muchos productos de biotecnología. Las sustancias biológicas que se producen en los cultivos celulares incluyen enzimas, hormonas, sustancias inmunobiológicas (anticuerpos monoclonales, interleuquinas, linfoquinas) y agentes anticáncer. Aunque proteínas mucho más sencillas pueden producirse utilizando células bacterianas, proteínas más complejas que son glicosiladas, deben producirse habitualmente en las células eucarióticas.

Las progenies celulares aviarias son particularmente útiles, ya que muchos virus que se utilizan en composiciones farmacéuticas, pueden replicarse sobre ellas. Más digno de mención es que varios virus sólo son capaces de crecer en las células aviarias. Este es, por ejemplo, el caso del Virus Ankara Modificado (MVA), que no puede crecer sobre la mayoría de las células de los mamíferos. Este poxvirus, que se obtiene de un Virus de la Vacuna mediante más de 500 pases en CEF, se utilizó en los primeros años setenta para vacunar a gente con inmunodeficiencias contra el virus de la viruela. Ahora, MVA se utiliza principalmente como vector para la terapia génica y con propósitos inmunoterápicos. Por ejemplo, MVA se utiliza como un vector para el gen MUC1 para vacunar pacientes contra los tumores que expresen este antígeno (Scholl et al., 2003, J. Biomed Biotechnol., 2003,3,194-201). Ya que MVA transporta el gen que codifica los antígenos HPV, se utiliza asimismo como un vector para el tratamiento terapéutico de lesiones cervicales de grado intenso. Más recientemente, el MVA ha sido el vector de elección para la preparación del tratamiento profiláctico contra nuevas enfermedades que han surgido recientemente, o de armas biológicas probables, tales como el virus del Nilo occidental y el ántrax.

Por tanto, son necesarias nuevas transcriptasas inversas de la telomerasa que pueden inmortalizar las células aviarias y más particularmente, de las células de los Anátidos.

Tal como se utiliza a través de esta solicitud completa, los términos "un" y "uno" se utilizan en el sentido de que significan "por lo menos uno", "por lo menos uno primero", "uno o más" o "una pluralidad" de los componentes o etapas a los que se haga referencia, a menos que el contexto se refiera claramente a otra cosa. Por ejemplo, el término "una

célula", incluye una pluralidad celular, incluyendo sus mezclas.

El término "y/o" cuando se utiliza en la presente memoria incluye el significado de "y", "o" y de "todas y cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término".

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "que comprende" y "comprende" hacen referencia a que los productos, composiciones y procedimientos incluyen los componentes o etapas a los que se hace referencia, pero sin excluir a otros. "Que está constituido esencialmente por", cuando se utiliza para definir productos, composiciones y procedimientos, significará la exclusión de otros componentes o etapas con cualquier significado esencial. Así, una composición formada esencialmente por los componentes que se enumeren, no excluirá contaminantes traza y transportadores farmacéuticamente aceptables. "Constituido por" hará referencia a la exclusión de más que los elementos traza de otros componentes o etapas.

La presente invención se refiere a un polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia aminoácida que posee por lo menos 80% de identidad de la secuencia aminoácida con la secuencia aminoácida SEC ID nº1 de la transcriptasa inversa de la telomerasa de Cairina moschata. En una forma de realización más preferida...

 


Reivindicaciones:

Reivindicaciones

1. Polipéptido aislado o recombinante que comprende una secuencia aminoácida que presenta por lo menos 80% de identidad de la secuencia aminoácida con la secuencia aminoácida SEC ID nº 1 de la transcriptasa inversa de la telomerasa de Cairina moschata y que presenta actividad TERT.

2. Molécula ácido nucleica aislada o recombinante que codifica un polipéptido según la reivindicación 1.

3. Molécula ácido nucleica aislada o recombinante según la reivindicación 2, en la que dicha molécula ácido nucleica comprende una secuencia ácido nucleica que presenta por lo menos 90% de identidad de secuencia ácido nucleica con respecto a la SEC ID nº

2.

4. Vector portador de una molécula ácido nucleica aislada o recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3.

5. Vector según la reivindicación 4, en el que dicho vector comprende dos secuencias homólogas con respecto a una secuencia de ADN diana.

6. Vector según la reivindicación 5, en el que dicha molécula ácido nucleica está rodeada por dichas secuencias homólogas.

7. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, en el que dicho vector comprende además un primer marcador de selección en el que dicho primer marcador de selección es un marcador de selección positivo y en el que dicho primer marcador de selección está rodeado por dichas secuencias homólogas.

8. Vector según la reivindicación 7, en el que dicho primer marcador de selección está rodeado por secuencias que permiten su supresión.

9. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que dicho vector comprende un segundo marcador de selección que no está rodeado por dichas secuencias homólogas y en el que dicho marcador de selección es un marcador de selección negativo.

10. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicho vector comprende un tercer marcador de selección, en el que dicho tercer marcador de selección

es un marcador de selección negativo y en el que dicho tercer marcador de selección se localiza entre las secuencias que permiten la supresión del primer marcador de selección.

11. Célula aviar transfectada por una molécula ácido nucleica según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3.

12. Célula aviar según la reivindicación 11, en la que dicha molécula ácido nucleica se inserta en el gen HPRT de dicha célula aviar.

13. Célula aviar según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la que dicha célula aviar procede de un animal que pertenece a la familia de los Anátidos, preferentemente a la especie Cairina moschata o Anas platyrhynchos.

14. Célula aviar según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que comprende además una secuencia ácido nucleica que codifica una sustancia de interés.

15. Célula aviar según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la que comprende además una casete de complementación que permite la propagación de un virus defectuoso.

16. Utilización de un polipéptido según la reivindicación 1, de una molécula ácida nucleica según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 o de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10 para la inmortalización de una célula aviar.

17. Utilización de una célula aviar según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, para la replicación de un virus vivo, atenuado, o recombinante, seleccionado preferentemente de entre el grupo constituido por poxvirus, adenovirus, retrovirus, herpesvirus, alfavirus, virus espumoso, y virus asociado a adenovirus.

18. Utilización de una célula aviar según la reivindicación 17, en la que el poxvirus es un virus de la vacuna, en particular un virus Ankara (MVA) modificado del virus de la vacuna.

19. Utilización de una célula aviar según la reivindicación 14, para la producción de una sustancia de interés.

20. Utilización de una célula aviar según la reivindicación 19, en la que dicha sustancia de interés se selecciona de entre el grupo constituido por factores de crecimiento, reguladores de crecimiento, anticuerpos, antígenos, interleuquinas, insulina,

G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, interferones, factores de coagulación sanguínea, o sus combinaciones.

21. Procedimiento para perpetuar una célula aviar que comprende la etapa que consiste en transfectar en dicha célula un vector según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque comprende además una etapa en la que dichas células aviarias se cultivan en un medio que sólo permite el crecimiento de las células que han incorporado el primer marcador de selección.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22, caracterizado porque comprende además una etapa en la que dichas células aviarias se cultivan en un medio que no permite el crecimiento de las células que han incorporado el segundo marcador de selección.

24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que dicho procedimiento comprende además una etapa que consiste en la exclusión del primer marcador de selección del genoma de dicha célula aviar.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que las células aviarias, obtenidas después de dicha etapa que consiste en la exclusión del primer marcador de selección a partir del genoma de dichas células aviarias, se cultivan en un medio que no permite el crecimiento de las células que comprenden el tercer marcador de selección.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en el que dicha célula aviar se toma de un organismo que pertenece a la familia de los Anátidos, preferentemente a las especies Cairina moschata o Anas platyrhynchos.

27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, en el que dicha molécula ácido nucleica se inserta en una secuencia de ADN diana de dicha célula, preferentemente en el gen HPRT.

 

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