SECUENCIA REGULADORA DE LA EXPRESIÓN ESPECÍFICA EN ANTERA DE UN GEN Y SU EMPLEO EN LA PRODUCCIÓN DE PLANTAS ANDROESTÉRILES Y SEMILLAS HÍBRIDAS.

Secuencia reguladora de la expresión específica en antera de un gen y su empleo en la producción de plantas androestériles y semillas híbridas Sector de la técnica Agricultura. La presente invención se relaciona con la obtención de secuencias de ADN reguladoras (promotores) y, usando dichas secuencias, la construcción de nuevos genes quiméricos capaces de expresarse de forma específica en las anteras de plantas transgénicas. La invención también se refiere a la obtención de plantas androestériles y semillas híbridas. Estado de la técnica Para provocar la expresión específica de determinados genes en las anteras de plantas transgénicas, se han aislado, caracterizado y utilizado diversos promotores. La expresión de estos promotores es específica en un determinado tejido de la antera. Algunos de ellos se han utilizado en técnicas de ablación celular para producir plantas estériles de gran utilidad para la producción de semillas híbridas. En la actualidad, la ablación genética de células vegetales está siendo utilizada para realizar estudios de función y señalización celular dentro de tejidos u órganos específicos y para generar androesterilidad (esterilidad masculina). La ablación genética se basa en la inducción de la muerte celular mediante la expresión de cualquier enzima que sea capaz de destruir la integridad celular como proteasas, lipasas y RNasas (p.e. barnasa y RNasa T1). Resultados equivalentes pueden obtenerse expresando sustancias tóxicas para las células [Day CD e Irish VF. Trends Plant Sci., 2: 106-111, 1997]. Un ejemplo de este último método es el uso de péptidos que inactivan los ribosomas como es el caso de la cadena A de la toxina de Corynebacterium diphtheria (DTA) y de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Varios grupos han sugerido la producción de androesterilidad via una sobreproducción de reguladores de crecimiento. La síntesis de auxinas o citoquininas usando genes de origen no vegetal, tal como los genes 1 y 2 del plasmido Ti, o los genes rol A, B y C del plásmido Ri, representan métodos donde estos factores se convierten en toxinas por la magnitud y momento inadecuado de su expresión.También se han desarrollado métodos que no destruyen el tejido directamente, sino que dan lugar a células susceptibles a agentes ablativos específicos. Un ejemplo de esta aproximación es el uso de un ARN antisentido de un gen previamente establecido. Esto confiere resistencia constitutiva a un agente químico, como por ejemplo la tolerancia a un herbicida (Fabijanski SF et al., In vitro Cell. Dev. Biol. 28: 46-52, 1992]. El efecto del ARN en antisentido es eliminar la resistencia química de forma específica, por ejemplo en polen, para que la aplicación del herbicida produzca la destrucción del polen. Este método convierte a un herbicida en un gametocida. Para obtener una eficiente ablación genética es crucial disponer de un gen citotóxico que actúe sólo allí donde se exprese y de un promotor apropiado que controle la expresión espacio-temporal del gen citotóxico. Por ello, la caracterización de promotores de genes activos en diferentes tipos celulares y/o en diferentes momentos durante la diferenciación de la antera ha permitido examinar las funciones de distintos tejidos de la antera durante la gametogénesis mediante ablación celular [Mariani C et al.Nature, 347: 737-741, 1990; Paul W et al., Plant Mol. Biol., 19: 611-622, 1992; Hird DL et al., Plant J., 4: 1023-1033, 1993], con particular énfasis en las interacciones célula a célula [Roberts MR et al., Sex. Plant Reprod., 8: 299-307, 1995]. Así mismo, esta técnica esta siendo empleada por grandes empresas productoras de semillas para el desarrollo de androesterilidad, característica deseable en los procesos de obtención de semillas híbridas [Williams ME, Trends Biotechnol., 13: 344-349, 1995]. En varios trabajos se ha analizado la función de las interacciones célula a célula durante el desarrollo de las estructuras reproductoras. Por ejemplo, se han usado varios promotores diferentes para dirigir la expresión de un gen citotóxico en las células del tapetum en la antera con el objetivo de determinar el efecto de la ablación en el desarrollo del polen [Mariani C et al., Nature 347: 737-741, 1990; Roberts MR et al., Sex. Plant Reprod. 8:299-307, 1995]. La ablación de las células tapetales en diferentes estadíos tiene efectos distintos en el desarrollo del polen. El uso de un promotor específico de células tapetales de tabaco (TA29) dirigiendo la expresión del gen barnasa (ribonucleasa) durante el estadío de tétrada del desarrollo del polen provoca androesterilidad, lo que indica que el tapetum es esencial para la producción de polen viable en este estadío (Mariani C et al., Nature 347: 737-741, 1990). En cambio, la sustitución del promotor TA29 por el promotor APG de Arabidopsis, específico de tapetum en el estadío de microspora del polen, no tiene ningún efecto sobre el polen [Roberts MR et al., Sex. Plant Reprod. 8:299- 307, 1995]. Este último dato indica que el tapetum no es esencial para la formación del polen a partir de la disgregación de las tétradas de microsporas. Un análisis histoquímico del desarrollo de la antera en plantas transgénicas de Brassica con la construcción TA29-barnasa mostró la degradación del ARN dentro de las células tapetales junto con la desaparición del ARN de las microsporas [De Block M y Debrouwer D, Planta 189: 218-225, 1993]. Esta observación sugiere que las microsporas permanecen permeables a pequeñas moléculas después del inicio de la deposición de esporopolenina y en fases tardías de su desarrollo ya que el promotor TA29 no dirige la expresión de genes en microsporas. 2   Beals TP y Goldberg RB [Plant Cell, 9: 1527-1545, 1997] pusieron en práctica una nueva estrategia de ablación celular para determinar qué tipos celulares de una antera están implicados en el proceso de dehiscencia. Transformaron plantas de tabaco con dos construcciones: la construcción formada por el promotor TA56, activo en el septum, en el estomio y en el tejido conectivo, y el gen barnasa junto con una de las siguientes construcciones de forma alternativa: a) el promotor TP12, activo en la mayoría de los tejidos de la antera, junto con el gen barstar (inhibidor de la barnasa), b) el promotor TA20, activo en la mayoría de los tejidos de la antera pero con un patrón de distribución distinto al de TA12, y el gen barstar y c) el promotor del gen de la lectina de soja, activo en las células del tejido conectivo, del septum y del estomio, más el gen barstar. El análisis de los diversos fenotipos de las plantas transgénicas demostró que el proceso de dehiscencia depende sólo de la presencia de un estomio funcional. Shull [J. Ind. Abst. Vererb. 12: 97-149, 1914] fue el primero en introducir el término heterosis para describir las ventajas que ofrecía la heterocigosis con respecto a la división celular, crecimiento y otras actividades fisiológicas de un organismo. El resultado de estas ventajas: incremento en tamaño, vigor, rendimiento, adelanto en la fructificación y resistencia a enfermedades promovió hace décadas el interés por obtener variedades híbridas [Tsaftaris SA, Physiol. Plantarum 94: 362-370, 1995]. La mayoría de las plantas que contienen órganos reproductores tanto masculinos como femeninos se auto-polinizan (maíz, arroz, soja, tomate, etc.) lo que ocasiona problemas en los procesos de producción de semillas híbridas [Kriete G et al., Plant J. 9: 809-818, 1996]. Para eludir este problema ha de usarse un sistema que controle la auto-polinización. Este sistema puede ser mecánico, químico o genético. El sistema mecánico consiste en eliminar manualmente las anteras de las flores (emasculación), lo que supone una labor ardua y económicamente costosa. El método químico se basa en el uso de productos químicos (gametocidas) que destruyen el polen específicamente produciendo una androesterilidad transitoria. Esta aproximación no es particularmente efectiva en cultivos con un periodo de floración muy extenso o con unas condiciones de floración variables e incontrolables. Además, la producción comercial de semillas híbridas via gametocidas se caracteriza por un elevado coste y relativa efectividad de los productos químicos. La mayoría de los sistemas de producción de semillas híbridas comerciales se apoyan en métodos genéticos para controlar la floración, de forma que usan plantas auto-incompatibles o plantas androestériles, es decir, plantas que no producen polen, no son capaces de liberarlo o desarrollan polen que no es capaz de provocar auto-fertilización [Horner HT y Palmer RG, Crop Sci. 35: 1527-1535, 1995]. La producción de plantas androestériles es de gran utilidad para la obtención de semillas híbridas. La esterilidad masculina elimina la posibilidad de autofecundación de la planta,... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia de nucleótidos reguladora de la expresión específica en antera de un gen seleccionada entre: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1; b) un fragmento de dicha SEQ ID NO 1 que mantiene la capacidad de regular la expresión específica en la antera; y c) una secuencia de nucleótidos con al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO 1 que mantiene la capacidad de regular la expresión específica en la antera. 2. Secuencia de nucleótidos reguladora según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 4. 3. Una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 y una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido, proteína, o ARN. 4. Un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o una construcción de ADN según la reivindicación 3. 5. Una célula huésped que comprende una una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o proteína heterólogo/a bajo el control de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido, proteína o ARN heterólogo/a bajo el control de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2. 6. Una planta transgénica que contiene una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o proteína heterólogo/a bajo el conrol de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido, proteína o ARN heterólogo/a bajo el control de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2. 7. Una planta transgénica según la reivindicación 6, en la que el péptido, polipéptido, proteína o ARN heterólogo/a es citotóxico y cuya expresión induce la ablación de la antera. 8. Una planta transgénica según la reivindicación 6, seleccionada entre monocotiledóneas y dicotiledóneas. 9. Un método para producir plantas androestériles, que comprende transformar una planta con una construcción de ADN según la reivindicación 3, comprendiendo dicha construcción de ADN una secuencia codificante de una actividad promotora de la esterilidad en plantas, controlada por una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, de manera que dicha la expresión de dicha secuencia codificante provoca la ablación de las anteras. 10. Un método para restaurar la fertilidad de una planta androestéril que comprende transformar dicha planta androestéril con una construcción de ADN según la reivindicación 3, comprendiendo dicha construcción una secuencia codificante de una actividad que revierte o restaura la fertilidad que inhibe la actividad de ablación de las anteras, controlada por una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.   Figura 1 21   Figura 2 22   Figura 2 (continuación) 23   Figura 3 24   Figura 4   Figura 5 Figura 6 26   Figura 7 27   Figura 8 28   Figura 9 29   Figura 10