RECOMBINASAS ALTERADAS PARA LA MODIFICACIÓN DEL GENOMA.

Un procedimiento in vitro de integración sitioespecífica de una secuencia de polinucleótidos de interés en un genoma de una célula de un organismo multicelular,

comprendiendo dicho procedimiento: introducir (i) una construcción directora circular que comprende un primer sitio de recombinación y la secuencia de polinucleótidos de interés, y (ii) una recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional en la célula, en el que el genoma de dicha célula comprende un segundo sitio de recombinación natural para el genoma y la recombinación entre el primer y el segundo sitio de recombinación se facilita por la recombinasa alterada, en el que dicho primer sitio de recombinación es un sitio de recombinación attB y dicho segundo sitio de recombinación es un pseudositio de recombinación attP, mantener la célula en condiciones que permitan la recombinación entre dicho primer y segundo sitio de recombinación, estando la recombinación mediada por la recombinasa alterada y siendo el resultado de la recombinación la integración sitioespecífica de la secuencia de polinucleótidos de interés en el genoma de la célula, en el que la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional está constituida por una secuencia de polipéptidos que es idéntica al menos el 80% a la recombinasa natural C31 de SEQ ID NO: 21 (distinta de la propia SEQ ID NO:21) y tiene actividad de integrasa, y en el que la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional tiene una especificidad de unión a ADN o un nivel de actividad que se diferencia del de una recombinasa natural sitioespecífica unidireccional y puede mediar en la recombinación entre un pseudositio de recombinación attP y un sitio de recombinación attB

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2001/005269.

Solicitante: THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 900 WELCH ROAD, SUITE 350 PALO ALTO, CA 94304-1850 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: CALOS,Michele,P. , SCLIMENTI,Christopher,R.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 16 de Febrero de 2001.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/90 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Introducción estable de ADN extraño en el cromosoma.
  • C12N9/00 C12N […] › Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas.

Clasificación PCT:

  • C07H21/04 C […] › C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N11/04 C12N […] › C12N 11/00 Enzimas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Células microbianas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Su preparación. › atrapadas en el interior del soporte, p. ej. en un gel o en fibras huecas.
  • C12N15/74 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes procariotas distintos a E. coli, p. ej. Lactobacillus, Micromonospora.
  • C12N15/87 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando procedimientos no previstos en otro lugar, p. ej. cotransformación.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

Clasificación antigua:

  • C07H21/04 C07H 21/00 […] › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N11/04 C12N 11/00 […] › atrapadas en el interior del soporte, p. ej. en un gel o en fibras huecas.
  • C12N15/74 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes procariotas distintos a E. coli, p. ej. Lactobacillus, Micromonospora.
  • C12N15/87 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando procedimientos no previstos en otro lugar, p. ej. cotransformación.
  • C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.


Fragmento de la descripción:

La presente invención se hizo con el respaldo de la subvención del NIH R01 DK55569 y R01 DK58187 del Instituto nacional de salud, Departamento de salud y servicio humanos de EE.UU. Por consiguiente, el gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en la invención. 5

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, y más específicamente al campo de la modificación genómica. En este documento se desvelan recombinasas alteradas que incluyen composiciones de las mismas, vectores de expresión y procedimientos de uso de los mismos para la generación de células, tejidos, plantas y animales transgénicos. Las composiciones, vectores y procedimientos de la presente invención también son útiles en técnicas de 10 terapia génica.

Antecedentes de la invención

La presente incapacidad para realizar la integración sitioespecífica eficaz de ADN entrante en los cromosomas de organismos superiores está retrasando los avances en la biología básica y aplicada. Recientemente se han descrito estrategias para la integración cromosómica que se aprovechan de la alta eficiencia y la estrecha especificidad de 15 secuencias de enzimas recombinasas aisladas de microorganismos. En particular, se ha mostrado que una clase de integrasas de fago que incluyen la integrasa C31 (Kuhstoss, S. y Rao, R. N., J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991); Rausch, H. y Lehmann, M., Nucleic Acids Research 19, 5187-5189 (1991)) funciona en células de mamífero (Groth, A. C., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5995-6000 (2000)).

Tales enzimas recombinasas específicas de sitio tienen largos sitios de reconocimiento de ADN que normalmente no 20 están presentes incluso en los grandes genomas de células de mamífero. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que en estos genomas están presentes pseudositios de recombinasa, es decir, sitios con un grado significativo de identidad con el sitio de unión natural para la recombinasa (Thyagarajan, B. y col., Gene 244, 47-54 (2000)).

Dorgai y col. (J. Mol. Biol., 252, 178-188 (1995) se refieren a la identificación de determinantes de especificidad de 25 recombinación en las integrasas del fago lambda y HK022.

La presente divulgación enseña procedimientos para alterar la especificidad de recombinasas para proporcionar recombinasas alteradas que puedan usarse más eficazmente en la ingeniería genética de los cromosomas de células superiores.

Resumen de la invención 30

La presente invención proporciona un procedimiento in vitro de integración sitioespecífica de una secuencia de polinucleótidos de interés en un genoma de una célula de un organismo multicelular, comprendiendo dicho procedimiento:

introducir (i) una construcción circular directora que comprende un primer sitio de combinación y la secuencia de polinucleótidos de interés, y (ii) una recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional en la célula, en el que el 35 genoma de dicha célula comprende un segundo sitio de recombinación natural para el genoma y la recombinación entre el primer y el segundo sitio de recombinación se facilita por la recombinasa alterada,

en el que dicho primer sitio de recombinación es un sitio de recombinación attB y dicho segundo sitio de recombinación es un pseudositio de recombinación attP,

mantener la célula en condiciones que permitan la recombinación entre dicho primer y segundo sitio de 40 recombinación, estando la recombinación mediada por la recombinasa alterada y siendo el resultado de la recombinación la integración sitioespecífica de la secuencia de polinucleótidos de interés en el genoma de la célula, en el que la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional está constituida por una secuencia de polipéptidos que es idéntica al menos el 80% a SEQ ID NO: 21 (distinta de la propia SEQ ID NO:21) y tiene actividad de integrasa, y en el que la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional tiene una especificidad 45 de unión a ADN o un nivel de actividad que se diferencia del de una recombinasa natural sitioespecífica unidireccional y puede mediar en la recombinación entre un pseudositio de recombinación attP y un sitio de recombinación attB.

La recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional puede estar constituida por una secuencia de polipéptidos que es idéntica al menos el 90%, por ejemplo el 95%, a SEQ ID NO:21. Ejemplos de tales polipéptidos se seleccionan del 50 grupo que está constituido por SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24.

El procedimiento de puede realizarse introduciendo la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional en la célula como un polipéptido, o introduciendo la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional en la célula como un polinucleótido que codifica la recombinasa alterada.

En un aspecto, el segundo sitio de recombinación es un sitio preseleccionado en dicho genoma. En un aspecto, el polinucleótido comprende una región de control, tal como un promotor. 5

El procedimiento de la invención puede realizarse usando una célula de mamífero, por ejemplo, una célula murina o humana.

En otro aspecto, la invención proporciona una recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional que comprende una secuencia de polipéptidos que es idéntica al menos el 80% a SEQ ID NO: 21 (distinta de la propia SEQ ID NO:21) y tiene actividad de integrasa, y en la que la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional tiene una especificidad de 10 unión a ADN o un nivel de actividad que se diferencia del de una recombinasa natural sitioespecífica unidireccional y puede mediar en la recombinación entre un pseudositio de recombinación attP presente en el genoma de una célula de organismo multicelular y un sitio de recombinación attB.

En algunos aspectos, dicha recombinasa es como se define anteriormente en relación con los procedimientos mencionados anteriormente. 15

La invención también proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional definida anteriormente, o del ácido nucleico definido anteriormente, en un procedimiento de integración de una secuencia de ADN en un genoma eucariota, por ejemplo, de mamífero. 20

En otro aspecto, la invención proporciona la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional definida anteriormente, o del ácido nucleico definido anteriormente, para uso en un procedimiento de integración de una secuencia de ADN en un genoma eucariota, por ejemplo, de mamífero.

La recombinasa alterada puede introducirse en la célula antes, simultáneamente a o después de introducirse la construcción directora circular. Además, la construcción directora circular puede comprender otros componentes útiles 25 tales como un origen bacteriano de replicación y/o un marcador de selección.

En este documento también se describe un procedimiento para identificar una recombinasa alterada. En el procedimiento normalmente se proporciona una población de células, comprendiendo las células de la población un primer plásmido (por ejemplo, un plásmido residente). El primer plásmido puede comprender una región promotora de la transcripción adyacente a un primer sitio de combinación adyacente al terminador de la transcripción adyacente a un 30 segundo sitio de recombinación adyacente a una secuencia codificante de interés. El orden de estos componentes es promotor-primer sitio de recombinación-terminador de la transcripción-segundo sitio de recombinación-secuencia codificante de interés, actuando dicho primer y segundo sitio de recombinación de sustratos para una primera recombinasa y la transcripción de ultralectura de la secuencia codificante de interés se minimiza o se elimina esencialmente. El promotor es funcional en la célula y un enlace factible de promotor y secuencia codificante de interés 35 resulta de un acontecimiento de recombinación entre los dos sitios de recombinación (es decir, se elimina el terminador de la transcripción).

Entonces, la población de células se transforma con un grupo (o población) de segundos plásmidos (por ejemplo, plásmidos de clonación). El grupo de plásmidos comprende al menos un segundo plásmido que comprende una secuencia codificante de una recombinasa alterada factible ligada...

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento in vitro de integración sitioespecífica de una secuencia de polinucleótidos de interés en un genoma de una célula de un organismo multicelular, comprendiendo dicho procedimiento:

introducir (i) una construcción directora circular que comprende un primer sitio de recombinación y la secuencia de polinucleótidos de interés, y (ii) una recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional en la célula, en el que 5 el genoma de dicha célula comprende un segundo sitio de recombinación natural para el genoma y la recombinación entre el primer y el segundo sitio de recombinación se facilita por la recombinasa alterada,

en el que dicho primer sitio de recombinación es un sitio de recombinación attB y dicho segundo sitio de recombinación es un pseudositio de recombinación attP,

mantener la célula en condiciones que permitan la recombinación entre dicho primer y segundo sitio de 10 recombinación, estando la recombinación mediada por la recombinasa alterada y siendo el resultado de la recombinación la integración sitioespecífica de la secuencia de polinucleótidos de interés en el genoma de la célula,

en el que la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional está constituida por una secuencia de polipéptidos que es idéntica al menos el 80% a la recombinasa natural C31 de SEQ ID NO: 21 (distinta de la 15 propia SEQ ID NO:21) y tiene actividad de integrasa, y en el que la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional tiene una especificidad de unión a ADN o un nivel de actividad que se diferencia del de una recombinasa natural sitioespecífica unidireccional y puede mediar en la recombinación entre un pseudositio de recombinación attP y un sitio de recombinación attB.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional está 20 constituida por una secuencia de polipéptidos que es idéntica al menos el 90% a SEQ ID NO:21.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional está constituida por una secuencia de polipéptidos que es idéntica al menos el 95% a SEQ ID NO:21.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional está constituida por una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que está constituido por SEQ ID NO:22, SEQ ID 25 NO:23 y SEQ ID NO:24.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional se introduce en la célula como un polipéptido.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional se introduce en la célula como un polinucleótido que codifica la recombinasa alterada. 30

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho segundo sitio de recombinación es un sitio preseleccionado en dicho genoma.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido comprende una región de control.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha región de control es un promotor.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha célula es una célula de mamífero. 35

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicha célula es una célula humana.

12. Una recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional que comprende una secuencia de polipéptidos que es idéntica al menos el 80% a SEQ ID NO: 21 (distinta de la propia SEQ ID NO:21) y tiene actividad de integrasa, y en la que la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional tiene una especificidad de unión a ADN o un nivel de actividad que se diferencia del de una recombinasa natural sitioespecífica unidireccional y puede mediar en la recombinación 40 entre un pseudositio de recombinación attP presente en el genoma de una célula de organismo multicelular y un sitio de recombinación attB.

13. La recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional de la reivindicación 12, en la que dicha recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional es idéntica al menos el 90% a SEQ ID NO:21.

14. La recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional de la reivindicación 12, en la que dicha recombinasa alterada 45 sitioespecífica unidireccional es idéntica al menos el 95% a SEQ ID NO:21.

15. La recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional de la reivindicación 12, en la que dicha recombinasa está constituida por una secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que está constituido por SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24.

16. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional de la reivindicación 12 a 15.

17. Uso ex vivo de la recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, o del ácido nucleico de la reivindicación 16, en un procedimiento de integración de una secuencia de ADN en un genoma eucariota. 5

18. Uso de la reivindicación 17 en el que dicho genoma es un genoma de mamífero.

19. Una recombinasa alterada sitioespecífica unidireccional de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, o del ácido nucleico de la reivindicación 16, para uso en un procedimiento de integración de una secuencia de ADN en un genoma eucariota.

20. La recombinasa o el ácido nucleico para uso según la reivindicación 19 en el que dicho genoma es un genoma de 10 mamífero.


 

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