Producción de una proteína de unión a IL-18 recombinante.

Un proceso para producir una proteína de unión a interleuquina-18 (IL-18BP) recombinante en células de ovario de hámster chino (CHO) en un biorreactor en condiciones de cultivo sin suero,

en el que el proceso es un proceso discontinuo que comprende las etapas de:

a) una fase de propagación celular a 37 ºC;

b) opcionalmente, una fase intermedia a 33 ºC;

c) una fase de producción a 29 ºC.

Producción de una proteina de unión a IL-18 recombinante.

Campo de la inveneian La presente invención pertenece al campo de la producción de proteinas. De modo mas especifico, se refiere a un proceso para la producción de una proteina de unión a IL-18 recombinante (IL-18BP) . La invención se refiere ademas a una composición de IL-18BP que se caracteriza por un perfil de glicosilación especifico.

Anteeedentes de la inveneian Las proteinas se han vuelto importantes desde el punto de vista comercial como farmacos que tambien se denominan en general "biológicos". Uno de los mayores retos es el desarrollo de procesos eficaces y rentables para la producción de proteinas recombinantes a escala comercial.

La industria de la biotecnologia utiliza con profusión celulas de mamifero para la fabricación de glicoproteinas recombinantes para la terapia humana.

En la actualidad, los cultivos semicontinuos y de perfusión son los dos modos dominantes de funcionamiento industrial para los procesos de cultivo de celulas de mamifero que requieren grandes cantidades de proteinas (Hu y Aunins, 1997) . Cualquiera que sea la elección de la tecnologia de producción, los intentos de desarrollo se dirigen a la obtención de procesos de producción que garanticen una alta productividad volumetrica, una coherencia entre los lotes, y una calidad homogenea del producto a bajo coste.

La decisión entre el modo de producción semicontinuo o de perfusión viene dictada principalmente por la biologia del clon y por la propiedad del producto, y se realiza basandose en cada caso durante el transcurso del desarrollo de un nuevo producto de farmaco (Kadouri y Spier, 1997) .

Cuando se selecciona el proceso de perfusión, uno de los sistemas de cultivo que puede elegirse es un biorreactor de lecho cargado estacionario, en el que las celulas se inmovilizan sobre vehiculos sólidos. Este sistema es facil de manejar y puede lograrse una densidad celular muy alta (aproximadamente 107-108 celulas.ml1) con los vehiculos y las condiciones de cultivo apropiadas.

Una consecuencia de esta alta densidad celular es la necesidad de una velocidad de perfusión del medio intensiva (alimentación y recolección) , que debe utilizarse para mantener a las celulas viables y productivas. Parece que la velocidad de perfusión es uno de los parametros fundamentales para dicho proceso: conduce la productividad de proteinas volumetrica, la calidad del producto de proteinas, y tiene un impacto muy fuerte sobre el coste económico global del proceso.

Por tanto, a escala industrial, el proceso del biorreactor de lecho cargado estacionario óptimo deberia funcionar con una velocidad de perfusión lo mas baja posible sin comprometer la cantidad y la calidad del producto.

En el transcurso de la reducción de la velocidad de perfusión se han realizado varios estudios en los que se emple6 la concentración de la glucosa (Wang et al., 2002) (Dowd et al., 2001) como indicador del nivel de otros nutrientes en el medio de alimentación para hacer funcionar el biorreactor a una velocidad de perfusión baja sin acumular en el cultivo altos niveles de subproductos t6xicos, tales como lactato y amoniaco (Sugiura y Kakuzaki, 1998) (Racher et al., 1993) . La modificación de los parametros del cultivo, tales como pH y temperatura (Chuppa et al., 1997) tambien es una estrategia habitual para optimizar las condiciones del cultivo y reducir las necesidades de perfusión del medio.

Para lograr una velocidad de perfusión óptima pueden considerarse tres estrategias:

a) Fijar la velocidad de perfusión a un valor constante durante la totalidad de la ejecución de la producción. Esta estrategia normalmente se prefiere en procesos de producción industrial, puesto que es mas sencillo su funcionamiento de una manera robusta y constante. Tambien tiene la ventaja de definir un coste medio del proceso porque no hay variación en la velocidad de perfusión de una ejecución a otra.

b) Ajustar la velocidad de perfusión en respuesta al numero de celulas y/o al consumo de nutrientes, tales como glucosa (Oh et al., 1994) (Dowd et al., 2001) (Gorenflo et al., 2003) , glutamina (Gorenflo et al., 2002) u oxigeno (Kyung et al., 1994) . Aunque esta estrategia proporciona un fundamento mas cientifico para ajustar la velocidad de perfusión, puede conducir un sobrecrecimiento del cultivo y a un aumento "fuera de control" de la velocidad de perfusión. Cuando las celulas se cultivan en el modo de suspensión se realiza un "sangrado del cultivo" para evitar el sobrecrecimiento del cultivo, pero esto no es posible cuando las celulas estan inmovilizadas sobre un vehiculo. Por tanto, en general esta estrategia no se prefiere para operaciones de fabricación, porque es dificil de ejecutar de una manera robusta y constante, y la velocidad de perfusión del medio debe reajustarse a diario.

c) Combinar ambas estrategias a) y b) con una fase de propagación celular inicial (o "fase de crecimiento") , en la

que la velocidad de perfusión aumenta de modo progresivo segun las necesidades de crecimiento de las celulas durante la fase de crecimiento, seguido de un desplazamiento de las condiciones de cultivo, tales como la temperatura y/o el pH, para estabilizar y mantener el metabolismo celular a un nivel relativamente bajo y constante. En esta etapa, la velocidad de perfusión puede reducirse hasta un valor fijo, que se corresponde con las menores necesidades de las celulas a lo largo de la fase de producción.

Se sabe que la modificación de la velocidad de perfusión durante un proceso de perfusión, asi como la modificación de otros factores del bioproceso, puede influir en la calidad de la proteina recombinante y, en particular, en su patrón de glicosilación (Jenkins et al., 1996) (Andersen et al., 2000) . La glicosilación habitualmente se reconoce como una función importante para la solubilidad, la inmunogenicidad, y las propiedades farmacocineticas de las glicoproteinas humanas, y estas son parametros clave en la seguridad y la eficacia clinica de un producto (Goochee et al., 1991) . En particular, la glicosilación afecta al plegamiento y a la secreción de muchas glicoproteinas, asi como a su semivida plasmatica, teniendo por tanto un impacto importante en la biologia y la actividad in vivo de las proteinas glicosiladas.

En general, el termino "glicosilación" de una proteina se refiere a la formación de un enlace azucar-aminoacido. La glicosilación es un acontecimiento crucial en la biosintesis de las unidades carbohidrato de las glicoproteinas (segregadas) . Pone en marcha una serie compleja de etapas enzimaticas postraduccionales que conducen a la formación de una multitud de oligosacaridos unidos a proteinas con diversas funciones biológicas.

Las glicoproteinas de mamifero normalmente contienen tres tipos de glicanos constituyentes: los glicanos Nenlazados, que se unen a la asparagina a traves de un resto N-acetilglucosamina (GlcNAc) en un motivo Asn-Xxx (Ser, Thr) , en el que Xxx puede ser cualquier aminoacido excepto prolina; los que estan unidos a serina o treonina, denominados glicanos O-enlazados; y los componentes de carbohidrato del glicosilfosfatidilinositol. Aunque son posibles muchas variaciones, las antenas de los glicanos maduros consisten habitualmente en una o mas unidades de N-acetil-lactosamina, terminando las cadenas en acido sialico o en galactosa α-enlazada. Con frecuencia se encuentra a la fucosa unida al resto GlcNAc unido a asparagina, y a menudo tambien en las antenas. Otras modificaciones habituales en la estructura basica incluyen un resto GlcNAc unido en la posición 4 del resto manosa ramificado de la parte central, denominado resto GlcNAc "bisecante", y grupos sulfato que pueden estar en una diversidad de localizaciones, en la parte central y en las antenas.

La biosintesis de estos compuestos implica la unión de la asparagina a un glicano que contenga la parte central de trimanosilquitobiosa, junto con seis restos manosa y tres restos glucosa adicionales, seguido de la eliminación de la glucosa y de los cuatro restos manosa. Entonces diversas otras glicosil transferasas y glicosidasas procesan la estructura de (GlcNAc) 2 (Man) 5 para producir el glicano maduro. Este proceso produce tres tipos generales de glicanos N-enlazados dependiendo del grado de procesamiento: glicanos "con alto contenido en manosa", en los que sólo hay restos manosa en las dos antenas; "glicanos hibridos", en los que una antena se procesa; y glicanos "complejos", en que se modifican ambas antenas. Los glicanos... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para producir una proteina de unión a interleuquina-18 (IL-18BP) recombinante en celulas de ovario de hamster chino (CHO) en un biorreactor en condiciones de cultivo sin suero, en el que el proceso es un proceso discontinuo que comprende las etapas de:

a) una fase de propagación celular a 37 °C; b) opcionalmente, una fase intermedia a 33 °C; c) una fase de producción a 29 °C.

2. El proceso segun la reivindicación 1, en el que.

3. El proceso segun la reivindicación 2, en el que la densidad celular total en la fase de producción varia entre 4 a 8

x 106 celulas por ml por dia a lo largo de al menos 10 dias de cultivo celular.

4. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la viabilidad varia entre 100% y 80%.

5. El proceso segun la reivindicación 4, en el que la viabilidad varia entre 100% y 80% a lo largo de al menos 10

dias de cultivo celular.

6. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la productividad de proteinas es mayor 15 que aproximadamente 150 mg o aproximadamente 350 mg por l por dia.

7. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas la etapa de recolectar el sobrenadante del cultivo celular.

8. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende ademas la etapa de purificar la IL

18BP. 2.

9. El proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende ademas la etapa de formular la IL18BP en una composición farmaceutica.