Proceso para el refinado de aceite comestible usando una lípido aciltransferasa.

Un método de desgomado con agua de un aceite comestible que comprende las etapas de:

a) mezclar 0,1-5% p/p deagua con aceite comestible y una lípido aciltransferasa, b) agitar la mezcla durante entre 10 minutos y 180 minutos a 45a 900C, y c) separar la fase de aceite y la fase de goma, en el que la lípido aciltransferasa usada tiene una actividadtransferasa (TrU) por mg de enzima de al menos 25 TrU/mg de proteína enzimática según se determina usando elensayo siguiente:

a) se disuelven 50 mg de colesterol y 450 mg de fosfatidilcolina (PC) de soja en cloroformo y el cloroformo se evapora a400C en vacío; se dispersan 300 mg de PC:colesterol 9:1 a 40ºC en 10 ml de 50 mM tampón HEPES pH 7 para formar elsustrato;

c) se añaden 250 μl de sustrato en un vaso con tapa a 40ºC, se añaden 25 μl de disolución de enzima y se incuba conagitación durante 10 minutos a 40ºC;

d) después de 10 minutos, se añaden 5 ml de Hexano:Isopropanol 3:2;

e) la cantidad de éster de colesterol se analiza por HPTLC usando estándar de estearato de colesterilo para lacalibración;

f) la actividad transferasa se calcula como la cantidad de la formación de éster de colesterol (en μmoles) por minuto

Proceso para el refinado de aceite comestible usando una lípido aciltransferasa REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Se hace referencia a las solicitudes relacionadas siguientes: US 2002-0009518, US 2004-0091574, WO2004/064537, WO2004/064987, WO2005/066347, WO2005/066351, Solicitud de los Estados Unidos Número de Serie 60/764.430 presentada el 2 de febrero 2006, WO20061008508, Solicitud de Patente Internacional Número PCT/IB2007/000558 y Solicitud de los Estados Unidos Número de Serie 11/671.953. En este texto también se citan varios documentos ("documentos citados en la presente memoria") .

CAMPO DE LA PRESENTE INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un proceso para el refinado de aceite comestible (preferiblemente aceite vegetal) usando una lípido aciltransferasa. La presente invención se refiere además a un proceso para tratar un aceite comestible (preferiblemente un aceite comestible crudo) (por ejemplo, un aceite vegetal) y/o una fase de goma de un aceite comestible (preferiblemente aceite vegetal) usando una lípido aciltransferasa.

ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCIÓN

Se sabe que las lípido aciltransferasas son ventajosas en las aplicaciones alimenticias. Se ha encontrado que las lípido aciltransferasas tienen una actividad aciltransferasa significativa en productos alimenticios. Esta actividad tiene aplicaciones beneficiosas sorprendentes en métodos para preparar productos alimenticios.

Por ejemplo, WO 2004/064537 describe un método para la producción in situ de un emulsionante por el uso de una lípido aciltransferasa y las ventajas asociadas con éste. WO2008/090395 enseña la expresión de lípido aciltransferasas en células huésped (heterólogas) .

El propósito del refinado de aceites comestibles es eliminar impurezas indeseables que afectan la calidad (sabor, olor y apariencia, por ejemplo) y la capacidad de almacenamiento.

Debido a la amplia variedad de estas impurezas- ácidos grasos libres, iones metálicos, compuestos con color, olores, gomas, etc. se emplean convencionalmente una serie de procesos de naturaleza química y física para el refinado (véase por ejemplo Bailey's Industrial Oil and Fat Products- 2006 John Wiley & Sons- Sexta Edición) .

Tradicionalmente, se han usado dos procesos para el desgomado del aceite que son los procesos de desgomado físico y desgomado químico.

En el denominado refinado químico, casi todo el contenido de ácidos grasos libres se elimina por tratamiento inicial con un gran exceso de NaOH. Además, el contenido de fosfolípidos disminuye hasta un nivel de fósforo típicamente por debajo de 10 ppm. El aceite se blanquea y desodoriza posteriormente.

El denominado refinado físico consiste generalmente en una etapa de desgomado con agua seguida de desgomado ácido, neutralización, blanqueo, extracción con vapor para eliminar los ácidos grasos libres y desodorización.

En lugar de usar desgomado ácido durante el refinado físico, se han hecho avances para usar desgomado enzimático.

El proceso de desgomado enzimático se desarrolló tomando como base el uso de fosfolipasa pancreática. Como esta enzima era no kosher, la fosfolipasa se sustituyó eventualmente por una fosfolipasa A1 microbiana (Lecitasa Ultra-Novozymes, Dinamarca) (Oil Mill Gazetteer, Vol 111 Julio 2005 p 2-4) .

El proceso enzimático tiene varias ventajas sobre los procesos de desgomado químico o físico incluyendo ahorro de costes, mayor rendimiento y un proceso más respetuoso con el medioambiente.

El proceso de desgomado enzimático de aceites se basó en la adición de una fosfolipasa a un aceite que se había desgomado ya con agua.

En WO2006/008508 se enseñaron las lípido aciltransferasas para uso en el desgomado enzimático de aceites comestibles. WO 2006/008508 enseña la adición de una lípido aciltransferasa a un aceite desgomado con agua o la adición de una lípido aciltransferasa a un aceite crudo sin la necesidad de que el aceite experimente un proceso de desgomado con agua.

El "aceite desgomado con agua" puede obtenerse típicamente por un proceso de desgomado con agua convencional que comprende mezclar 1-2% p/p de agua blanda caliente con aceite crudo templado (70-900) (AOCS Intoduction to the Processing of Fats and Oils-Tabla 8- Procesos de Desgomado -http://www.aocs.org/meetingsleducationlmod3sample.pdf) . Una norma general es que la cantidad de agua añadida al aceite crudo es típicamente aproximadamente igual a la cantidad de fosfolípidos en el aceite crudo. Los periodos de tratamiento habituales son 30-60 minutos. La etapa de desgomado con agua elimina los fosfátidos y gomas mucilaginosas que se vuelven insolubles en el aceite cuando se hidrata. Los fosfátidos y gomas hidratadas pueden separarse del aceite por sedimentación, filtración o centrifugación- siendo la centrifugación la práctica más predominante. El objeto esencial en dicho proceso de desgomado con agua es separar los fosfátidos hidratados del aceite. El mezclado de agua caliente en el aceite, descrito anteriormente, debe entenderse en la presente memoria ampliamente como el mezclado de una disolución acuosa en el aceite según los procedimientos de desgomado con agua estándar en la técnica.

En el proceso de desgomado con agua convencional, la parte principal de los fosfátidos se elimina en una fase de goma pesada. Al final del proceso de desgomado con agua se separa una fase de aceite de una fase de goma. Aunque la fase de goma puede procesarse más en productos comerciales, se ve esencialmente como un subproducto del refinado del aceite. Es la fase de aceite la que es comercialmente importante. Sin embargo, como los fosfátidos pueden ser buenos emulsionantes, parte del aceite se pierde inevitablemente en la fase de goma durante el desgomado con agua. Esto da lugar a rendimientos reducidos de aceite en la fase de aceite después del desgomado con agua.

Con los incrementos en los precios del aceite y una necesidad creciente de aceite vegetal para biodiesel es importante optimizar el procesamiento de los aceites comestibles para un alto rendimiento del aceite.

ASPECTOS RESUMEN DE LA PRESENTE INVENCIÓN

Los aspectos de la presente invención se presentan en las reivindicaciones y en el comentario siguiente.

Se ha encontrado sorprendentemente que mediante la adición de una o más lípido aciltransferasas a un aceite comestible crudo durante o antes de llevar a cabo un proceso de desgomado con agua, el rendimiento del aceite en la fase de aceite puede incrementarse significativamente. En otras palabras, las pérdidas de aceite en la fase de forma pueden reducirse significativamente.

Además, se ha encontrado sorprendentemente que mediante la adición de una o más lípido aciltransferasas a un aceite comestible crudo durante o antes de llevar a cabo un proceso de desgomado con agua la fase de goma obtenida es mucho menos viscosa. Esto puede permitir parámetros de centrifugación más favorables.

También se ha encontrado sorprendentemente que mediante la adición de una o más lípido aciltransferasas a un aceite comestible crudo durante o antes de llevar a cabo un proceso de desgomado con agua la fase de goma obtenida a partir de este proceso puede incubarse o almacenarse y (debido a la lípido aciltransferasa activa residual) puede observarse una hidrólisis adicional de fosfolípidos en la fase de goma. Los inventores han encontrado que es posible aislar una fase de aceite que contiene ácidos grasos libres (el aceite ácido) y los triglicéridos remanentes en la fase de goma. Este aceite ácido puede venderse con un valor mayor que la fase de goma normal que se añade a los alimentos. Además, se ha encontrado sorprendentemente que la fase sólida remanente (después de la separación del aceite ácido) tiene un nivel de fósforo mayor que la goma normal y así puede usarse como una fuente de fósforo orgánico.

También se ha encontrado sorprendentemente que la combinación de una o más lípido aciltransferasas y una o más enzimas fosfolipasa C (PLC) resulta en efectos sinérgicos cuando se usan en el desgomado de aceites comestibles (por ejemplo, aceites vegetales) .

ASPECTOS DETALLADOS DE LA PRESENTE INVENCIÓN

Según un primer aspecto de la presente invención se proporciona un proceso de desgomado con agua de un aceite comestible (preferiblemente un aceite comestible crudo) que comprende las etapas de:

a) mezclar 0, 1-5% p/p de agua con un aceite comestible (preferiblemente un aceite comestible crudo) y una lípido aciltransferasa, b) agitar la mezcla durante entre 10 minutos y 180 minutos a 450C a 900C, y c) separar la fase de aceite y la fase de goma, en el que la lípido aciltransferasa usada tiene una... [Seguir leyendo]

1. Un método de desgomado con agua de un aceite comestible que comprende las etapas de: a) mezclar 0, 1-5% p/p de agua con aceite comestible y una lípido aciltransferasa, b) agitar la mezcla durante entre 10 minutos y 180 minutos a 45 a 900C, y c) separar la fase de aceite y la fase de goma, en el que la lípido aciltransferasa usada tiene una actividad transferasa (TrU) por mg de enzima de al menos 25 TrU/mg de proteína enzimática según se determina usando el ensayo siguiente:

a) se disuelven 50 mg de colesterol y 450 mg de fosfatidilcolina (PC) de soja en cloroformo y el cloroformo se evapora a 400C en vacío; se dispersan 300 mg de PC:colesterol 9:1 a 400C en 10 ml de 50 mM tampón HEPES pH 7 para formar el sustrato;

c) se añaden 250 μl de sustrato en un vaso con tapa a 400C, se añaden 25 μl de disolución de enzima y se incuba con agitación durante 10 minutos a 400C;

d) después de 10 minutos, se añaden 5 ml de Hexano:Isopropanol 3:2;

e) la cantidad de éster de colesterol se analiza por HPTLC usando estándar de estearato de colesterilo para la calibración;

f) la actividad transferasa se calcula como la cantidad de la formación de éster de colesterol (en μmoles) por minuto.

2. Un método según la reivindicación 1 en el que el método comprende además d) incubar la fase de goma que comprende la enzima lípido aciltransferasa activa durante entre un mínimo de 2 horas y un máximo de 7 días y e) separar el aceite de la fase de goma.

3. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la lípido aciltransferasa es un polipéptido que tiene actividad lípido aciltransferasa, polipéptido que se obtiene por la expresión de:

a) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 49 o una secuencia de nucleótidos que tiene 75% o más de identidad con ésta;

b) un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido en el que dicho polipéptido es al menos 70% idéntico a la secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID No. 16 o a la secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID No. 68;

c) o un ácido nucleico que hibrida en condiciones de astringencia media con una sonda de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 49.

4. Un método según la reivindicación 3 en el que la lípido aciltransferasa es un polipéptido obtenido por la expresión de las secuencias de nucleótidos en Bacillus licheniformis.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la lípido aciltransferasa es un polipéptido que tiene actividad lípido aciltransferasa, polipéptido que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 35 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con éstas.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la lípido aciltransferasa es un polipéptido que tiene actividad lípido aciltransferasa, polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 68 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con ésta.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que una fosfolipasa C se mezcla adicionalmente con el aceite y/o agua y/o lípido aciltransferasa.

8. Uso de una lípido aciltransferasa en el desgomado con agua de un aceite comestible para incrementar el rendimiento de aceite en la fase de aceite después de la finalización del proceso de desgomado con agua; en el que 0, 1-4% p/p de agua se mezcla con el aceite comestible; la enzima se añade a un aceite comestible a una temperatura en el intervalo de 45 a 900C; y la lípido aciltransferasa se hace reaccionar con el aceite comestible durante entre 10 minutos a 180 minutos, en el que la lípido aciltransferasa usada tiene una actividad transferasa (TrU) por mg de enzima de al menos 25 TrU/mg de proteína enzimática según se determina usando el ensayo siguiente:

a) se disuelven 50 mg de colesterol y 450 mg de fosfatidilcolina de soja en cloroformo y el cloroformo se evapora a 400C en vacío; se dispersan 300 mg de PC:colesterol 9:1 a 400C en 10 ml de 50 mM tampón HEPES pH 7 para formar el sustrato;

c) se añaden 250 μl de sustrato en un vaso con tapa a 400C, se añaden 25 μl de disolución de enzima y se incuba con agitación durante 10 minutos a 400C;

d) después de 10 minutos, se añaden 5 ml de Hexano:Isopropanol 3:2;

e) la cantidad de éster de colesterol se analiza por HPTLC usando estándar de estearato de colesterilo para la calibración;

f) la actividad transferasa se calcula como la cantidad de la formación de éster de colesterol (en μmoles) por minuto.

9. Uso de una lípido aciltransferasa en el desgomado con agua de un aceite comestible para disminuir la viscosidad de la fase de goma después de la finalización del proceso de desgomado con agua; en el que 0, 1-4% p/p de agua se mezcla con el aceite comestible; la enzima se añade a un aceite comestible a una temperatura en el intervalo de 45 a 900C; y la lípido aciltransferasa se hace reaccionar con el aceite comestible durante entre 10 minutos a 180 minutos, en el que la lípido aciltransferasa usada tiene una actividad transferasa (TrU) por mg de enzima de al menos 25 TrU/mg de proteína enzimática según se determina usando el ensayo siguiente:

a) se disuelven 50 mg de colesterol y 450 mg de fosfatidilcolina de soja en cloroformo y el cloroformo se evapora a 400C en vacío; se dispersan 300 mg de PC:colesterol 9:1 a 400C en 10 ml de 50 mM tampón HEPES pH 7 para formar el sustrato;.

c) se añaden 250 μl de sustrato en un vaso con tapa a 400C, se añaden 25 μl de disolución de enzima y se incuba con agitación durante 10 minutos a 400C;

d) después de 10 minutos, se añaden 5 ml de Hexano:Isopropanol 3:2;

e) la cantidad de éster de colesterol se analiza por HPTLC usando estándar de estearato de colesterilo para la calibración;

f) la actividad transferasa se calcula como la cantidad de la formación de éster de colesterol (en μmoles) por minuto.

10. Uso de una lípido aciltransferasa en combinación con una fosfolipasa C en el desgomado con agua de un aceite comestible para incrementar el rendimiento de aceite y/o para incrementar los niveles de triglicérido en la fase de aceite después de la finalización del proceso de desgomado con agua y/o para reducir el nivel de diglicérido en la fase de aceite después de la finalización del proceso de desgomado con agua; en el que 0, 1-4% p/p de agua se mezcla con el aceite comestible; la enzima se añade a un aceite comestible a una temperatura en el intervalo de 45 a 900C; y la lípido aciltransferasa se hace reaccionar con el aceite comestible durante entre 10 minutos a 180 minutos, en el que la lípido aciltransferasa usada tiene una actividad transferasa (TrU) por mg de enzima de al menos 25 TrU/mg de proteína enzimática según se determina usando el ensayo siguiente:

a) se disuelven 50 mg de colesterol y 450 mg de fosfatidilcolina de soja en cloroformo y el cloroformo se evapora a 400C en vacío; se dispersan 300 mg de PC:colesterol 9:1 a 400C en 10 ml de 50 mM tampón HEPES pH 7 para formar el sustrato;

c) se añaden 250 μl de sustrato en un vaso con tapa a 400C, se añaden 25 μl de disolución de enzima y se incuba con agitación durante 10 minutos a 400C;

d) después de 10 minutos, se añaden 5 ml de Hexano:Isopropanol 3:2;

e) la cantidad de éster de colesterol se analiza por HPTLC usando estándar de estearato de colesterilo para la calibración;

f) la actividad transferasa se calcula como la cantidad de la formación de éster de colesterol (en μmoles) por minuto.

11. El método o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 8-10, en el que el pH del proceso de desgomado es entre pH 5, 0 a pH 10, 0.

12. El método o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 8-11, en el que la lípido aciltransferasa comprende un resto GDSx y/o un resto GANDY.

13. El método o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 8-12, en el que la enzima lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad aciltransferasa y que comprende el resto de la secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno o más de los residuos de aminoácidos siguientes L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M o

S.

14. El método o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 8-13, en el que la lípido aciltransferasa puede obtenerse a partir de un organismo de uno o más de los géneros siguientes: Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas y Candida.

15. El método o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 8-13, en el que la lípido aciltransferasa se obtiene por la expresión de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas como SEQ ID No. 49, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 42, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 50, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 62 o SEQ ID No. 63 o una secuencia de nucleótidos que tiene 75%

o más de identidad con éstas.

16. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-15, en el que la lípido aciltransferasa es un polipéptido obtenido por la expresión de:

a. la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 49 o una secuencia de nucleótidos que tiene 75% o más de identidad con ésta;

b. un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido en el que dicho polipéptido es al menos 70% idéntico a la secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID No. 16 o a la secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID No. 68; o

c. un ácido nucleico que hibrida en condiciones de astringencia media con una sonda de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID No. 49.

17. Uso según la reivindicación 16, en el que la lípido aciltransferasa es un polipéptido obtenido por la expresión de las secuencias de nucleótidos en Bacillus licheniformis.

18. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-17, en el que la lípido aciltransferasa es un polipéptido que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 35 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75% o más de identidad con éstas.

19. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-18, en el que la lípido aciltransferasa es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID No. 68 o una secuencia de aminoácidos que tiene 75%

o más de identidad con ésta.

20. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-19, en el que la lípido aciltransferasa se usa en combinación con una fosfolipasa C.