PROCEDIMIENTO Y SISTEMA PARA LA ESTABILIZACIÓN DEL ÁCIDO ARAQUIDÓNICO PARA SU USO EN UN ENSAYO DE FUNCIÓN DE PLAQUETAS.

Método y sistema para la estabilización de ácido araquidónico para su uso en un ensayo de función plaquetaria ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención: [0001] La presente invención se refiere a métodos y sistemas para estabilizar el ácido araquidónico (AA), y más particularmente a métodos y sistemas para estabilizar el AA en un ensayo de función plaquetaria de un solo uso. Descripción de la técnica relacionada: [0002] El papel de las plaquetas en la fisiología de mamíferos es extraordinariamente diverso, pero su papel 15 primario está en la promoción de la hemostasia. En muchas situaciones, se desea una evaluación de la capacidad de la sangre para coagular, un parámetro que está frecuentemente controlado por la capacidad de las plaquetas para adherirse y/o agregarse. Por lo tanto, es de interés la evaluación de las funciones adhesivas de las plaquetas. Por ejemplo, las cuestiones de interés incluyen si administrar fármacos que bloquearán, o promoverán, la formación de coágulos, o detectar deficiencias en la función plaquetaria antes de procedimientos quirúrgicos. También es de 20 interés evaluar la eficacia de un inhibidor de plaquetas que esté siendo ensayado como un nuevo fármaco o se esté usando como tratamiento químico autorizado en un paciente. [0003] La agregación de plaquetas desempeña un papel clave en la patogénesis de la trombosis y la arteriopatía coronaria aguda. Las pruebas sugieren que existe una variabilidad significativa de la función plaquetaria en la respuesta a diversos agentes antiplaquetarios. En particular, la aspirina se usa ampliamente por sus efectos antiplaquetarios en pacientes con síndromes coronarios agudos (ACS). Los beneficios clínicos de la aspirina en los ACS se deben en parte a su capacidad para inhibir el tromboxano A2 (TXA2), que se sabe que causa la agregación de plaquetas, por la acetilación irreversible de la enzima ciclooxigenasa 1 (COX-1). 30 [0004] La agregación de plaquetas es una expresión usada para describir la unión de plaquetas entre sí. La agregometría de plaquetas in vitro es el método de laboratorio usado para evaluar la capacidad in vivo de las plaquetas para formar los agregados que conducen a un tapón hemostático primario. En esta técnica, una muestra de sangre completa tratada con anticoagulante se centrifuga en múltiples condiciones para crear tanto una muestra de plasma rico en plaquetas (PRP) como de plasma pobre en plaquetas (PPP). Después se añade un agente de 35 agregación al PRP y la agregación de plaquetas se controla ópticamente mientras que en paralelo a esto se realiza una medición óptica separada usando la muestra de PPP. El porcentaje de agregación se determina después mediante el uso del canal de PPP como el nivel de referencia de agregación del 100% para comparar con el canal de PRP. 40 [0005] Helena Laboratories (Beaumont, TX), un fabricante de sistemas de agregometría plaquetaria para uso de laboratorio proporciona bibliografía educativa que sugiere el agente de agregación apropiado depende del propósito del ensayo. Para evaluar los efectos de la aspirina sobre la función plaquetaria, Helena Laboratories expone que El ensayo de agregación de plaquetas de ácido araquidónico es la única forma práctica de controlar los efectos de la terapia con aspirina, usada ampliamente en la actualidad para prevenir ictus y ataques al corazón. Helena 45 Laboratories, Evaluation of Platelet Function Wall Chart 586-25. El ácido araquidónico es un ácido graso presente en los gránulos y membranas de las plaquetas humanas. Marcus AJ: Platelet lipids. En Coleman RW, Hirsh J, Marder VJ, Salzman EW: Hemostasis and thrombosis: Basic principles and clinical practice, pág. 472. JB Lippencott Company, Philadelphia 1982. Se libera a partir de fosfolípidos y, en presencia de la enzima ciclooxigenasa uno (COX-1), incorpora oxígeno para formar el endoperóxido prostaglandina G2 (PGG2). La PGG2 se transforma 50 después rápidamente en prostaglandina H2 (PGH2), que a su vez se convierte en tromboxano A2, un potente inductor de la agregación de plaquetas. La ingestión de aspirina o compuestos que contienen aspirina inhibe el consumo de oxígeno mediado por COX-1, impidiendo de este modo todos los acontecimientos posteriores que conducen a la agregación plaquetaria. Bye A, Lewis Y, O'Grady J: Effect of a single oral dose of aspirin on the platelet aggregation response to arachidonic acid. Br J Clin Pharmac 7: 283, 1979. [0006] La adición in vitro de ácido araquidónico a plasma rico en plaquetas normal da como resultado una explosión en el consumo de oxígeno, la formación de tromboxano y la agregación de plaquetas. Moncada S, Vane JR: Arachidonic acid metabolites and the interactions between platelets and blood vessel walls. N Eng J Med 300: 1142, 1979. Sin embargo, en presencia de aspirina o compuestos que contienen aspirina, estas reacciones están 60 ausentes. Ingerman CM, Smith JB, Shipiro S, Sedar A, Silver A, Silver MJ: Hereditary abnormality of platelet aggregation attributable to nucleotide storage pool deficiency, Blood 52: 332, 1978.   [0007] La exposición con el uso de ácido araquidónico en entornos clínicos es la naturaleza relativamente inestable del compuesto. Cuando se expone a oxígeno, el ácido araquidónico experimenta un proceso denominado autooxidación. La autooxidación se define generalmente como una reacción química que habitualmente tiene lugar a temperatura ambiente entre el oxígeno atmosférico y un compuesto orgánico. Son ejemplos comunes de los 2 fenómenos de autooxidación el pardeamiento de la fruta, el aherrumbrado del metal y la degeneración de productos de goma. La autooxidación causa que el ácido araquidónico se vuelva amarillo y se deteriore rápidamente. En un uso de laboratorio típico, el ácido araquidónico se almacena a -20ºC en ampollas inertes selladas y, una vez descongelado, se recomienda usarlo en las 24 horas siguientes. Hojas de Datos de Sigma-Aldrich A9673 y A8798. Como alternativa, algunos fabricantes liofilizan una versión basada en sal del ácido araquidónico, pero de nuevo el material debe almacenarse en una ampolla inerte sellada a -20ºC y usarse inmediatamente tras su apertura. En el entorno clínico existe con frecuencia poca antelación de la necesidad de ejecutar un ensayo particular, y la necesidad de gestionar la cantidad de material a descongelar, y el posterior uso del material de una forma oportuna es engorroso y además requiere mucho tiempo. [0008] Otro aspecto de la autooxidación del ácido araquidónico de importancia particular para su uso como activador de plaquetas es que la autooxidación ex vivo del ácido araquidónico no crea necesariamente los mismos subproductos que la oxidación in vivo, y en algunos casos puede producir subproductos estables que imiten al TXA2. El uso de ácido araquidónico que se hubiera degradado de esta forma en un ensayo para evaluar los efectos de la aspirina indicaría falsamente que la aspirina no estaba teniendo efecto sobre la agregación de plaquetas. [0009] Los fenómenos de autooxidación podrían prevenirse mediante la exclusión total de oxígeno u otras sustancias oxidantes, pero en general esto no es práctico. En su lugar, lo que se hace más típicamente es utilizar inhibidores que disminuyan la velocidad de reacción o prolonguen el periodo de inducción. Sin embargo, una prevención completa de la autooxidación es improbable. Las sustancias que pueden suprimir la autooxidación se denominan inhibidores o antioxidantes. Los inhibidores preventivos disminuyen la velocidad de autooxidación suprimiendo la velocidad de las reacciones de iniciación. Los antioxidantes es su verdadero sentido son sustancias que pueden inhibir las etapas de propagación; es decir, interrumpen las reacciones de la cadena de autooxidación porque después de ceder su electrón están todavía en una configuración estable. Los antioxidantes se usan comúnmente en la conservación de alimentos, para evitar que los alimentos se enrancien, se pardeen o desarrollen manchas negras. Los antioxidantes también minimizan los daños a algunos aminoácidos esenciales y la pérdida de algunas vitaminas. Los dos tipos comunes de antioxidantes usados en los alimentos son ácidos y compuestos fenólicos. Los ejemplos de antioxidantes ácidos son ácidos ascórbico y cítrico, mientras que los compuestos antioxidantes fenólicos incluyen BHA, BHT, TBHQ, Tocoferoles, Lecitina, THBP, Goma y Glicina. [0010] Debido a las dificultades con el almacenamiento y la manipulación, ningún analizador clínico de la función plaquetaria utiliza actualmente ácido araquidónico para medir la respuesta de las plaquetas a la aspirina. En su lugar, sistemas como el Dade Behring PFA-100® o el Plateletworks® usan una combinación de activadores de plaquetas tales como difosfato de adenosina (ADP), colágeno... [Seguir leyendo]

1. Un método para medir la inhibición de plaquetas en una muestra de sangre completa obtenida de una persona tratada con aspirina, que comprende: proporcionar dentro de un envase de dispositivo de ensayo de un solo uso un reactivo de ensayo liofilizado que contiene ácido araquidónico a una concentración suficiente para activar al máximo las plaquetas de la muestra de sangre completa y un antioxidante que reduce la velocidad de oxidación del ácido araquidónico y no interfiere con la función plaquetaria, en el que dicho envase de dispositivo de ensayo de un solo uso comprende además un absorbente de oxígeno para crear un entorno inerte después del envasado del dispositivo de ensayo de un solo uso; y dicho dispositivo de ensayo de un solo uso es estable a temperatura ambiente durante al menos tres meses; y combinar dicha muestra de sangre completa con dicho reactivo de ensayo liofilizado dentro de un recipiente adecuado y medir la aglutinación de plaquetas en dicha muestra. 2. El método de la reivindicación 1, en el que el reactivo de ensayo liofilizado se utiliza con partículas recubiertas con un ligando de receptor GPIIb/IIIa. 3. El método de la reivindicación 1, en el que el reactivo de ensayo liofilizado incluye partículas recubiertas con un compuesto que da como resultado una aglutinación específica de plaquetas. 4. El método de la reivindicación 3, en el que el compuesto se selecciona de un anticuerpo contra un receptor de plaquetas y ligandos del receptor GPIIb/IIIa. 25 5. El método de la reivindicación 4, en el que el ligando del receptor GPIIb/IIIa se selecciona de fibrinógeno, anticuerpo monoclonal 10E5, anticuerpo monoclonal c7E3, factor de von Willebrand, fibronectina, vitronectina, ligandos que tienen una secuencia de arginina glicina-ácido aspártico (RGD), y otros péptidos o peptidomiméticos que imiten esta secuencia. 30 6. El método de la reivindicación 3, en el que las partículas son de un tamaño de entre aproximadamente 0,1 micrones y aproximadamente 20 micrones. 7. El método de la reivindicación 3, en el que las partículas son de un tamaño de entre aproximadamente 0,1 micrones y aproximadamente 10 micrones. 8. El método de la reivindicación 3, en el que las partículas son de un tamaño de entre aproximadamente 1 micrón y no más de 8 micrones. 9. El método de la reivindicación 3, en el que las partículas tienen una densidad de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 1,5 g/ml. 10. El método de la reivindicación 3, en el que las partículas están funcionalizadas o pueden funcionalizarse para unirse covalentemente. 11. El método de la reivindicación 3, en el que el compuesto está recubierto sobre las partículas. 12. El método de la reivindicación 11, en el que el compuesto está recubierto sobre las partículas por unión covalente. 50 13. El método de la reivindicación 3, en el que una proporción de moléculas de compuesto respecto a partículas está controlada en la unión de moléculas de compuesto a la partícula.   14. El método de la reivindicación 3, en el que las partículas tienen áreas de adsorción bloqueadas. 15. El método de la reivindicación 3, en el que las partículas incluyen un marcador. 16. El método de la reivindicación 15, en el que el marcador es una porción usada con el fin de la detección. 17. El método de la reivindicación 3, en el que las partículas incluyen al menos un colorante que absorbe en el infrarrojo. 18. El método de la reivindicación 1, en el que una cantidad de muestra analizada es de aproximadamente 30 l a aproximadamente 5000 l. 19. El método de la reivindicación 3, en el que la muestra se trata con un medio acuoso. 11 20. El método de la reivindicación 19, en el que se usa un codisolvente polar con el medio acuoso. 21. El método de la reivindicación 19, en el que el medio acuoso incluye al menos un tampón. 5 22. El método de la reivindicación 21, en el que un pH para el medio acuoso es de aproximadamente 2 a aproximadamente 11. 23. El método de la reivindicación 21, en el que un pH del medio acuoso es de aproximadamente 4 a aproximadamente 9. 24. El método de la reivindicación 19, en el que un volumen del medio acuoso es de aproximadamente 25 a aproximadamente 500 microlitros. 25. El método de la reivindicación 19, en el que un volumen del medio acuoso es de aproximadamente 75 a aproximadamente 250 microlitros. 26. El método de la reivindicación 19, que comprende además: incubar la muestra y el medio acuoso para aglutinar las partículas. 27. El método de la reivindicación 26, que comprende además: medir la aglutinación de las partículas para determinar la actividad de la función plaquetaria. 25 28. El método de la reivindicación 26, en el que la muestra y el medio acuoso se incuban a una temperatura de al menos 25ºC.   29. El método de la reivindicación 26, en el que la muestra y el medio acuoso se incuban a una temperatura de aproximadamente 30-40ºC. 30. El método de la reivindicación 27, que comprende además: comparar una aglutinación medida de las partículas frente a un patrón de actividad de la función plaquetaria conocida. 31. El método de la reivindicación 27, en el que la aglutinación de las partículas se detecta como un aumento en la transmisión de luz infrarroja a través de la muestra. 32. Un dispositivo de ensayo de un solo uso para medir la inhibición de plaquetas en una muestra de sangre completa obtenida de una persona tratada con aspirina, que comprende: un alojamiento con una pluralidad de canales y un orificio común de introducción de la muestra de sangre acoplado a cada uno de la pluralidad de canales; y una pluralidad de reactivos, situados en canales separados de dicha pluralidad de canales, incluyendo la pluralidad de reactivos, dentro de un reactivo de ensayo liofilizado, ácido araquidónico a una concentración suficiente para activar al máximo las plaquetas de la muestra de sangre completa y un antioxidante que reduce la velocidad de oxidación del ácido araquidónico y no interfiere con la función plaquetaria, en el que dicho dispositivo de ensayo de un solo uso es estable a temperatura ambiente durante al menos tres meses. 33. Un dispositivo de ensayo de un solo uso para medir la inhibición de plaquetas en una muestra de sangre completa obtenida de una persona tratada con aspirina, que comprende: un reactivo de ensayo liofilizado que contiene ácido araquidónico a una concentración suficiente para activar al máximo las plaquetas de la muestra de sangre completa y un antioxidante que reduce la velocidad de oxidación del ácido araquidónico y no interfiere con la función plaquetaria; un absorbente de oxígeno para crear un entorno inerte después del envasado del dispositivo de ensayo de un solo uso; y un envase de dispositivo de ensayo de un solo uso que incluye dicho reactivo de ensayo liofilizado y dicho absorbente de oxígeno, en el que dicho dispositivo de ensayo de un solo uso es estable a temperatura ambiente durante al menos tres meses. 12   REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido. Documentos de patentes citados en la descripción Literatura diferente de patentes citadas en la descripción 13