PROCEDIMIENTO PARA LA REDUCCIÓN ENZIMÁTICA ENANTIOSELECTIVA DE COMPUESTOS HIDROXICETO.

Proceso para la reducción enzimática enantioselectiva de una hidroxicetona de fórmula general I **Fórmula** en donde R1 = alquilo C1-C6 y R2 = -Cl,

-CN, -OH, -H o alquilo C1-C6, a un diol quiral de fórmula general II **Fórmula** en el que R1 y R2 tienen el mismo significado que en la fórmula I, en donde la hidroxicetona se reduce con una oxidorreductasa en presencia de un cofactor, caracterizado en que, la oxidorreductasa a) muestra una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 50% de los aminoácidos son idénticos a los de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, en donde la secuencia de aminoácidos no es Candida magnoliae IFO 0705, b) está codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15, o c) está codificada por una secuencia de ácido nucleico que en condiciones rigurosas hibrida con SEQ ID NO: 20 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/012037.

Solicitante: IEP GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: RHEINGAUSTRASSE 190-196 65203 WIESBADEN ALEMANIA.

Inventor/es: GUPTA,ANTJE,DR, TSCHENTSCHER,ANKE, BOBKOVA,MARIA.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 14 de Diciembre de 2006.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12P13/00 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno.
  • C12P41/00B
  • C12P7/62 C12P […] › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Esteres de ácidos carboxílicos.

Clasificación PCT:

  • C12P13/00 C12P […] › Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno.
  • C12P41/00 C12P […] › Procesos que utilizan enzimas o microorganismos para la separación de isómeros ópticos a partir de una mezcla racémica.
  • C12P7/62 C12P 7/00 […] › Esteres de ácidos carboxílicos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2363374_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

La invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de una hidroxicetona de

**(Ver fórmula)**

en la que R1 = alquilo C1-C6 y R2 = -Cl, -CN, -OH, -H o alquilo C1-C6, a un diol quiral de fórmula general II

**(Ver fórmula)**

10 en la que R1 y R2 tienen el mismo significado que en la fórmula I, en donde la hidroxicetona se reduce con una oxidorreductasa en presencia de un cofactor.

Los dioles quirales de la fórmula general II son compuestos intermedios importantes en la producción de medicamentos, en particular en la producción de inhibidores de HMG-CoA-reductasa. Tales dioles quirales son, por 15 ejemplo, (3R,5S)-6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo, (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo

o (5S,3R)-3,5,6-trihidroxihenaoato de terc-butilo.

Los dioles de esta clase se producen en particular mediante la reducción enantioselectiva de las correspondientes hidroxicetonas de fórmula I, como por ejemplo, (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, (5S)-6-cloro-5hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo o (5S)-5,6-dihidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo. La reducción química catalizada tiene al mismo tiempo el inconveniente que por una parte, debido a las duras condiciones de reacción puede producir subproductos, y por otra parte produce excesos enantioméricos o diastereoméricos insuficientes y técnicamente solo se puede realizar de forma muy laboriosa. Por este motivo desde hace tiempo se hacen esfuerzos para desarrollar procedimientos biocatalíticos, que permitan la reducción enantioselectiva de las hidroxicetonas mencionadas. Los procedimientos biocatalíticos normalmente operan en condiciones moderadas, por lo que se espera que hagan posible la reducción de los derivados 5-hidroxi3-oxohexanoato, que de todos modos son bastante inestables, sin la formación de subproductos adicionales. Sin embargo, hasta ahora no se ha podido encontrar ningún biocatalizador apropiado con el que sea posible la reducción enzimática de los derivados 5-hidroxi-3-oxohexanoato mencionados de forma efectiva y con enzimas aisladas.

La patente de EE UU 6.001.615 y la solicitud internacional de patente WO 01/85975 A1, por ejemplo, describen la reducción de (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo o (5S)-5,6-dihidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, con diferentes levaduras de los géneros Beauvaria, Pichia, Candida, Kluyveromyces y Toruplaspora. Las conversiones tienen lugar en efecto solo con células enteras de las cepas salvajes y por tanto solo se pudieron llevar a cabo a concentraciones muy bajas, muy por debajo del 5%. Las secuencias de la enzima y ADN responsables de las conversiones no se han podido identificar hasta la fecha.

40 Además se describen conversiones microbianas de compuestos estructuralmente similares en el documento EP 0 569 998 B1. En el mismo se pudo purificar incluso una enzima dependiente de NADH de Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305, que también se usa aislada junto con glucosa deshidrogenasa para la regeneración de coenzimas. En el proceso descrito se usa el sustrato en concentraciones del 1% y se alcanza un “número total de recambio” (“total turn over number”) de NADH de solo 10. No se muestra un procedimiento industrial aplicable.

45 En la patente de EE UU 6.645.746 B1 se divulga una secuencia de aminoácidos de Candida magnoliae que se puede usar para reducir (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo a (3R,5S)-6-cloro-3,5dihidroxihexanoato de terc-butilo con ayuda de NADPH. En la descripción de este documento se usa preferiblemente la enzima coexpresada con glucosa deshidrogenasa de Bacillus megaterium, en donde la regeneración del cofactor

50 NADPH se produce con ayuda de la glucosa deshidrogenasa y con glucosa como cosustrato.

El documento WO 2004/111083 A describe un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de cetonas, en particular ésteres de 2- y 3-oxoácidos, estando catalizada la reacción por una oxidorreductasa de Pichia capsulata.

55 En el documento WO 2005/108593 A se describe un procedimiento para la producción de 1-butanol, en el que se reduce 2-butanona con una carbonilreductasa, por ejemplo de Candida parapsilosis, y una coenzima en un sistema de dos fases.

Es el objeto de la invención proporcionar un procedimiento que permite la producción económica de dioles enantioméricamente puros de fórmula general II con mayor rendimiento y mayor pureza enantiomérica sin subproductos.

El objeto anteriormente mencionado se soluciona según la invención mediante un proceso del tipo mencionado al principio según el cual la oxidorreductasa

a) muestra una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 50% de los aminoácidos son idénticos a los de la

secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, en donde la

secuencia de aminoácidos no es Candida magnoliae IFO 0705,

b) está codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15, o

c) está codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 en condiciones rigurosas.

Se ha encontrado que los polipéptidos con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 11 muestran actividad oxidorreductasa y se pueden usar para reducir (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de tercbutilo a (3R,5R)-6-ciano-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo con un exceso diastereomérico de >99%. De la misma manera se pueden reducir otras hidroxicetonas de la fórmula general I por medio de las secuencias de aminoácidos SEQ IDNO: 1, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 11.

Además, las oxidorreductasas anteriormente mencionadas tienen la ventaja de que son capaces de regenerar el cofactor oxidado producido en la reducción mediante la reducción de un alcohol secundario. Una ventaja económica particular de la oxidorreductasa mencionada consiste también en que, al contrario que en los procesos de la técnica anterior (documentos US 6.645.746 B y EP 0 569 998 B) no se debe emplear ninguna enzima adicional para la regeneración del cofactor.

Una secuencia de ADN SEQ ID NO: 2, que codifica el polipéptido con la SEQ ID NO: 1, se puede obtener, por ejemplo del genoma del organismo Rubrobacter xylanophilus DSM 9941. Además se ha encontrado que la secuencia de ADN SEQ ID NO: 3 se puede usar para expresar el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en Escherichia.

Una secuencia de ADN SEQ ID NO: 9, que codifica el polipéptido con la SEQ ID NO: 8, se puede obtener, por ejemplo del genoma del organismo Geobacillus thermodenitrificans DSM 465. Además se ha encontrado que la secuencia de ADN SEQ ID NO: 10 se puede usar para expresar el polipéptido de SEQ ID NO: 8 en Escherichia.

Una secuencia de ADN SEQ ID NO: 12, que codifica el polipéptido con la SEQ ID NO: 11, se puede obtener, por ejemplo del genoma del organismo Chloroflexus aurantiacus DSM 635.

Una secuencia de ADN SEQ ID NO: 15, que codifica el polipéptido con la SEQ ID NO: 14, se puede obtener, por ejemplo del genoma del organismo Candida magnoliae CBS 6396.

La presente invención se refiere por tanto a un proceso para la reducción de hidroxicetonas de fórmula general I a dioles de fórmula general II mediante el uso de un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, o un polipéptido que muestra una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, esto es, un polipéptido que puede derivar mediante sustitución, inserción, deleción o adición de al menos un aminoácido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, en donde la secuencia de aminoácidos no es Candida magnoliae IFO 0705, o mediante el uso de un polipéptido, codificado por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 15 o que está codificado por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con SEQ ID: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 15 en condiciones rigurosas.

Mediante una secuencia de ácido nucleico que por ejemplo hibrida con SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas, se entiende un polinucleótido que se... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Proceso para la reducción enzimática enantioselectiva de una hidroxicetona de fórmula general I

**(Ver fórmula)**

en donde R1 = alquilo C1-C6 y R2 = -Cl, -CN, -OH, -H o alquilo C1-C6, a un diol quiral de fórmula general II

**(Ver fórmula)**

en el que R1 y R2 tienen el mismo significado que en la fórmula I, en donde la hidroxicetona se reduce con una oxidorreductasa en presencia de un cofactor, caracterizado en 10 que, la oxidorreductasa

a) muestra una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 50% de los aminoácidos son idénticos a los de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, en donde la secuencia de aminoácidos no es Candida magnoliae IFO 0705,

15 b) está codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15, o

c) está codificada por una secuencia de ácido nucleico que en condiciones rigurosas hibrida con SEQ ID NO: 20 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15.

2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado en que el cofactor se reduce continuamente con un cosustrato.

25 3. Proceso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado en que se usa NAD(P)H como cofactor.

4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado en que se usa 2-propanol, 2-butanol, 2pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-heptanol o 2-octanol como cosustrato y alcohol secundario, respectivamente.

30 5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado en que la hidroxicetona se usa en una cantidad del 5-50% en peso, preferiblemente del 8-40% en peso, en particular del 10-25% en peso, referido al volumen total de reacción.

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado en que como hidroxicetona de fórmula general (I) se usa (5R)-6-ciano-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo, (5S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo o (5S)-5,6-dihidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo.

7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado en que el TTN (“total turn over number”

, número total de recambio = moles de hidroxicetona reducida/moles de cofactor usado) es ≥103. 40

8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado en que se lleva a cabo en un sistema bifásico acuoso orgánico.

9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado en que se usa adicionalmente un

45 disolvente orgánico como dietiléter, terc-butilmetil éter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de etilo, acetato de butilo, heptano, hexano o ciclohexano.


 

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