Procedimiento de preparación de un concentrado de factor de von Willebrand (FvW) mediante cromatografía y concentrado de FvW susceptible de ser así obtenido.

Procedimiento de preparación de un concentrado de factor de von Willebrand de pureza muy elevada a partir deuna fracción biológica que contiene factor de von Willebrand,

caracterizado porque comprende una separaciónmediante cromatografía de intercambio de aniones usando un soporte de polímero vinílico, de tipo base débil,incluyendo dicha separación las etapas de

a) - carga del soporte cromatográfico con la fracción que contiene elfactor de von Willebrand, previamente equilibrado con un tampón adecuado, a un caudal predeterminado, lo quepermite la retención del factor de von Willebrand;

b) - lavado del soporte con un tampón ácido con un caudal superior al de la etapa a) hasta eliminar las proteínasy los contaminantes no retenidos;

c) - enjuague y equilibrado del soporte cromatográfico con el tampón y el caudal de la etapa a); y

d) - elución del factor de von Willebrand por aumento en la fuerza iónica del tampón de la etapa c).

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E05291553.

Solicitante: LABORATOIRE FRANCAIS DU FRACTIONNEMENT ET DES BIOTECHNOLOGIES.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: ZONE D'ACTIVITÉ DE COURTABOEUF, 3, AVENUE DES TROPIQUES 91940 LES ULIS FRANCIA.

Inventor/es: POULLE, MICHEL, CHTOUROU,SAMI, MARTEL,SERGE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K38/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
  • C07K1/18 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 1/00 Procedimientos generales de preparación de péptidos. › Cromatografía de intercambio iónico.
  • C07K14/755 C07K […] › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Factores VIII.

PDF original: ES-2450967_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento de preparación de un concentrado de factor de von Willebrand (FvW) mediante cromatografía y concentrado de FvW susceptible de ser así obtenido La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de un concentrado de factor de von Willebrand (FvW) mediante cromatografía.

El factor de von Willebrand es una proteína sanguínea multimérica cuyo peso molecular se sitúa entre aproximadamente 200 kDa y alrededor de 20 000 kDa, o incluso más. Esta proteína, sintetizada por las plaquetas y las células endoteliales, desempeña un papel fundamental en la lucha contra la hemorragia sanguínea, ya que el FvW actúa como un tampón gelificable que se extiende sobre una brecha vascular proporcionando adhesión de plaquetas para lograr la primera fase de la hemostasia, es decir, la formación del "tapón plaquetario" (trombo) . Alrededor de este trombo se van a organizar los fenómenos de coagulación destinados a consolidar la detención del sangrado por formación de un coágulo de fibrina insoluble. El FvW también garantiza la estabilización y el transporte del Factor VIII en la circulación sanguínea, con el que está asociado en forma de complejos de tamaños variables, que se encuentra así protegido contra una rápida degradación mediante proteólisis debido a la sensibilidad del Factor VIII aislado frente a las proteasas.

Una deficiencia congénita en el FvW o mutaciones genéticas que modifiquen las propiedades del FvW conlleva la enfermedad de Willebrand, que se manifiesta, por lo tanto, por perturbaciones en la hemostasia primaria y en la coagulación.

Es esencial, por tanto, para el tratamiento de esta enfermedad, disponer de derivados de plasma humano enriquecidos en FvW de elevada pureza compatibles con inyecciones múltiples y repetidas. En efecto, las muestras de FvW insuficientemente purificadas procedentes del fraccionamiento del plasma humano contienen diferentes contaminantes (proteínas residuales) que pueden inducir respuestas inmunológicas adversas. Además, la administración de factor de von Willebrand asociado al factor VIII puede conllevar un riesgo de trombosis o de hipercogulabilidad para el paciente tratado (Makris y col., Thromb.Haemost, 88, 2002, pp. 377-378, Manucci P.M., Thromb.Haemost, 88, 2002, pp. 378-379) .

Diversos procedimientos de preparación de concentrados de FvW asocian típicamente etapas de precipitación de una fracción de plasma, destinadas a eliminar la mayor parte de las proteínas indeseables (fibrinógeno, fibronectina, etc.) , y/o cromatográficas (intercambio iónico, de afinidad, de inmunoafinidad, de exclusión por tamaños, etc.) destinadas a la obtención de concentrados de gran pureza, que tengan una actividad específica elevada, y que permiten conservar la integridad de las formas multiméricas, especialmente las de elevado peso molecular cuya importancia biológica es fundamental en los procesos de cicatrización.

A modo de ejemplo, se puede citar la patente EP 0 359 593 que divulga la separación de proteínas de una fracción de plasma crioprecipitado que utiliza varias etapas de cromatografía de intercambio de aniones conducentes a la purificación del FvW.

La patente EP 0 503 991 divulgue un procedimiento de preparación a la escala industrial de un concentrado de FvW que comprende una etapa de prepurificación de una fracción crioprecipitada de plasma y tres etapas sucesivas de cromatografía, siendo la tercera una cromatografía de afinidad en columna de gelatina inmovilizada sobre agarosa. El concentrado de FvW así obtenido muestra una actividad específica superior a 100 UI RCo/mg expresada en unidades de actividad del cofactor de ristocetina por mg de proteína y un índice de multímeros de alto peso molecular comparable al del plasma inicial.

La solicitud de patente EP 0 934 748 describe un procedimiento de preparación del FvW que incluye la combinación de cromatografías de intercambio de aniones y de intercambio de cationes. Las fracciones de FvW obtenidas presentan una actividad específica superior a 100 UI de FvW:Ag/mg expresada en unidades de antígeno de FvW por mg de proteína, pero que contienen proporciones más notables de factor VIII.

La patente US 6 579 723 describe un procedimiento de preparación de un FvW muy purificado mediante cromatografía de inmunoafinidad cuyos inmunoadsorbentes representan anticuerpos dirigidos contra FvW. Se puede preferir igualmente una etapa de purificación adicional mediante cromatografía de afinidad de heparina. Sin embargo, el inconveniente de una purificación por inmunoafinidad es la posible presencia de anticuerpos residuales que puedan provocar reacciones inmunológicas.

La patente EP 0 383 234 enseña la preparación de un concentrado de FvW pasteurizado mediante cromatografía de intercambio de aniones, que se utiliza con disoluciones ácidas (pH de 5, 5 a 6, 5) que contienen hidratos de carbono, para fijar el factor VIII en el intercambiador de aniones. La recuperación conjunta de FvW, fibronectina y fibrinógeno no retenidos, mediante lavado del soporte, requiere etapas de precipitación adicionales para aislar un concentrado de FvW purificado.

Los procedimientos descritos anteriormente presentan el inconveniente de requerir varias etapas sucesivas, especialmente cromatográficas, lo que supone problemas de rendimiento y lentitud de aplicación a escala industrial.

Pueden utilizar, según los casos, soportes cromatográficas con ligandos de origen animal, tales como a base de gelatina, heparina o colágeno susceptibles de ser vehículo del prion patógeno responsable de la encefalopatía espongiforme u otros virus específicos de la especie animal considerada. Estas dificultades aumentan debido a la necesidad de incluir en el procedimiento una inactivación viral y, en su caso, etapas adicionales de eliminación de agentes virucidas. Además, los concentrados de FvW obtenidos por dichos procedimientos no están exentos de factor VIII, lo que presenta el inconveniente de riesgos de trombosis en los pacientes. Además, la limpieza o lavado de los soportes de afinidad así como su desinfección sigue siendo difícil debido a la fragilidad del ligando, que impide el uso de disoluciones limpiadoras de propiedades desinfectantes fuertes (lejía, carbonato de sodio, carbonato de potasio, etc.) . Finalmente, los soportes de afinidad tienen duraciones bastante cortas y su sustitución frecuente representa una importante carga financiera que aumenta el precio de coste del producto tratado.

Teniendo en cuenta las crecientes necesidades de fracciones de FvW muy puras, el solicitante se ha propuesto poner a punto un procedimiento para la preparación de FvW, cuya aplicación es muy simple, de alto rendimiento, que no requiere el uso de soportes cromatográficos con ligandos de origen animal y que da lugar a un concentrado de FvW de gran pureza, normalizado, con una actividad específica muy elevada y exento de factor VIII.

A este efecto, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de un concentrado de factor de von Willebrand de pureza muy elevada a partir de una fracción biológica que contiene factor de von Willebrand, caracterizado porque comprende una separación mediante cromatografía de intercambio de aniones usando un soporte de polímero vinílico, de tipo base débil, incluyendo dicha separación las etapas de a) carga del soporte cromatográfico con la fracción que contiene el factor de von Willebrand, previamente equilibrado con un tampón adecuado, a un caudal predeterminado, lo que permite la retención del factor de von Willebrand; b) lavado del soporte con un tampón ácido con un caudal superior al de la etapa a) hasta eliminar las proteínas y los contaminantes no retenidos; c) enjuague y equilibrado del soporte cromatográfico con el tampón y el caudal de la etapa a) ; y d) elución del factor de von Willebrand por aumento en la fuerza Iónica del tampón de la etapa c) .

De este modo, el solicitante ha descubierto que es posible gracias a un procedimiento muy simple lograr un concentrado de FvW de mayor calidad, con una actividad específica muy elevada y prácticamente exento de factor

VIII. El solicitante ha podido demostrar más concretamente que la selección razonada del soporte cromatográfico intercambiador de aniones tipo polímero vinílico y de las condiciones físico-químicas especiales de lavado de este soporte (pH ácido, caudal aumentado) permite separar, en una sola etapa, el FvW retenido por el soporte del resto de proteínas, especialmente el factor VIII, y otros compuestos contaminantes presentes en la fracción biológica que contiene el FvW.

De forma ventajosa, la separación cromatográfica se lleva a cabo sobre un soporte sintético, resina o gel, cuya matriz es de tipo... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de preparación de un concentrado de factor de von Willebrand de pureza muy elevada a partir de una fracción biológica que contiene factor de von Willebrand, caracterizado porque comprende una separación mediante cromatografía de intercambio de aniones usando un soporte de polímero vinílico, de tipo base débil,

incluyendo dicha separación las etapas de a) -carga del soporte cromatográfico con la fracción que contiene el factor de von Willebrand, previamente equilibrado con un tampón adecuado, a un caudal predeterminado, lo que permite la retención del factor de von Willebrand;

b) -lavado del soporte con un tampón ácido con un caudal superior al de la etapa a) hasta eliminar las proteínas y los contaminantes no retenidos; 10 c) -enjuague y equilibrado del soporte cromatográfico con el tampón y el caudal de la etapa a) ; y

d) -elución del factor de von Willebrand por aumento en la fuerza iónica del tampón de la etapa c) .

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la separación cromatográfica se lleva a cabo sobre un soporte de tipo polímero vinílico injertado con grupos intercambiadores de aniones que representan el DEAE.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el soporte cromatográfico representa un copolímero de oligoetilenglicol, metacrilato de glicodiílo y metacrilato de pentaeritritol en el que se han injertado grupos intercambiadores de aniones de tipo base débil, tales como DEAE.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el tampón de equilibrio (etapa a) o c) ) se compone de cloruro de sodio.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la concentración de cloruro de sodio es de 0, 11

M.

6. Procedimiento según la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque el tampón de equilibrado comprende además citrato trisódico, cloruro de calcio, glicina y lisina, con un pH comprendido entre 6, 9 y 7, 1.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque las concentraciones de los componentes del 25 tampón de equilibrado representan respectivamente, 0, 01 M, 0, 001 M, 0, 12 M y 0, 016 M.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el tampón ácido de lavado está ventajosamente compuesto de una sal alcalina o alcalinotérrea de ácido acético, cítrico o fosfórico, en una concentración comprendida entre 10 y 30 mM y un pH comprendido entre 3, 9 y 5, 2.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el tampón ácido de lavado representa un tampón 30 acetato de sodio 20 mM y pH 4, 35.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el caudal en la etapa de lavado corresponde a un valor superior al de la etapa de equilibrado a) en un factor de aproximadamente 1, 5 a 2.

11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque en la etapa d) , la

fuerza iónica del tampón de la etapa c) está aumentada por adición de cloruro de sodio cuya concentración final se 35 lleva a 0, 15-0, 17 M.

12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque comprende una etapa de inactivación vírica de la fracción biológica por disolvente-detergente.

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende después de la etapa de elución d) , una o varias etapas adicionales de

- filtración esterilizante,

-filtración de eliminación vírica,

-diafiltración,

-ultrafiltración de concentración,

-adición de un estabilizante farmacéuticamente aceptable.

45. liofilización,

-calentamiento en seco de inactivación vírica y,

-reconstitución del liofilizado caliente en un medio acuoso compatible para uso clínico.


 

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