Procedimiento de preparación de albúmina humana con nivel de oxígeno disuelto reducido.

Procedimiento de preparación de albúmina humana con nivel de oxígeno disuelto reducido.

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de una solución de albúmina humana, más en particular, se refiere a un procedimiento que comprende una etapa de reducción del oxígeno disuelto en dicha solución de albúmina hasta una concentración igual o menor que 0,5 ppm. Con el procedimiento de la presente invención es posible obtener una solución de albúmina humana con un estado redox más cercano al estado redox de la albúmina presente en el plasma humano.

Procedimiento de preparación de albúmina humana con nivel de oxígeno disuelto reducido

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de una solución de albúmina humana, más en particular, se refiere a un procedimiento que comprende una etapa de reducción del oxígeno disuelto en dicha solución de albúmina hasta una concentración igual o menor que 0,5 ppm. Con el procedimiento de la presente invención es posible obtener una solución de albúmina humana con un estado redox más cercano al estado redox de la albúmina presente en el plasma humano.

La albúmina humana es una proteína no glicosilada de 66 kDa. Cuantitativamente, es la proteína más importante del plasma y su concentración en el plasma normal se encuentra entre 35 y 50 g/L, constituyendo hasta el 60% del total de proteínas plasmáticas (Peters T. J.: All About Albumin; Biochemistry, Genetics and Medical Applications. Academic Press, San Diego, 1996).

La estructura de la albúmina humana consiste en un polipéptido de 585 aminoácidos y aproximadamente un 67% de hélices alfa sin estar presentes hojas beta (Otagiri M., Chuang V.T. Pharmaceutically important pre- and posttranslational modifications of human serum albumin. Biol Pharm Bull 2009; 32:527-534). La albúmina humana contiene 6 residuos de metionina y 35 de cisteína, implicados en la formación de 17 enlaces disulfuro. La Cys-34 es la única cisteína libre en toda la molécula. La albúmina humana presenta funciones antioxidantes específicas debido a su capacidad de unión a múltiples ligandos y propiedades de atrapamiento de radicales, ambas estrechamente relacionadas con su estructura.

Aunque existen muchas posibilidades de oxidación de la albúmina, Cys-34 es un sitio particularmente sensible a la oxidación/reducción. Por lo tanto, en general, es legítimo hablar del estado redox de la albúmina en términos de Cys-34. Mediante la separación cromatográfica de la albúmina, se obtienen tres fracciones según el estado redox de Cys-34 (Peters, 1996 anterior):

(i) la forma reducida con la cisteína en forma de grupo tiol libre, denominada mercaptoalbúmina humana (HMA);

(ii) la forma oxidada con la cisteína formando un enlace disulfuro con un compuesto de tiol pequeño, principalmente cisteína o cisteinilglicina, aunque también con homocisteína y glutatión, denominada no mercaptoalbúmina humana 1 (HNA1); y

(iii) la forma más oxidada con la cisteína como ácido sulfínico o sulfónico, denominada no mercaptoalbúmina humana 2 (HNA2).

En una persona sana saludable, aproximadamente el 50-69% de la albúmina total se encuentra en forma de HMA, el 27-42% en forma de HNA1 y el 3-5% en forma de HNA2 (Oettl K., y otros. Oxidative damage of albúmina in advanced liver disease. Biochim Biophys. Acta 2008; 1782: 469-473; Oettl K. y Marsche G. Redox State of Human Serum Albumin in Terms of Cysteine-34 in Health and Disease. Methods Enzymol. 2010; 474:181-95; y Oettl K. y otros. Oxidative albúmina damage in chronic liver failure: relation to albúmina binding capacity; liver dysfunction and survival. J Hepatol, 2013, 59:978-983). Por lo general, se cree que la oxidación de HMA a HNA1 es reversible, mientras que la oxidación a HNA2 resulta en un proceso irreversible.

La albúmina puede sufrir diversas modificaciones estructurales tanto in vivo como durante los procedimientos empleados para producir la albúmina terapéutica, lo que hace que se modifique su conformación y, por tanto, sus propiedades de unión, así como su estado redox (Oettl, K. y otros, 2010 citado anteriormente).

El método habitualmente utilizado en el fraccionamiento del plasma humano para la obtención de proteínas purificadas, entre las que se encuentra la albúmina, es el llamado método de Cohn (Cohn E.J.y otros. "Preparation and properties of serum plasma proteins, IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. J. Am. Chem. Soc. (1946) 68, 459-475) o modificaciones menores del mismo.

El método de Cohn parte de plasma humano, que se somete a sucesivas etapas de precipitación y separación. En cada una de ellas se obtiene un precipitado enriquecido en alguna de las proteínas plasmáticas y un sobrenadante de decantación. Para conseguir la precipitación de las sucesivas fracciones de Cohn (Fracción I, Fracción ll+lll, Fracción IV y Fracción V) es necesario modificar parámetros de la solución con el fin de variar la solubilidad de las distintas proteínas tales como pH, constante dieléctrica, temperatura, concentración proteica y fuerza iónica, entre otros. Cabe señalar, además, que dichas fracciones de Cohn contienen concentraciones crecientes de etanol. Así pues, la albúmina

contenida en el sobrenadante de la Fracción IV es precipitada con etanol aproximadamente al 40% (v/v) y pasa a formar parte de la pasta de la Fracción V.

Una vez obtenida la Fracción V, ésta es resuspendida en una solución y se somete a diferentes etapas hasta obtener el producto final. Habitualmente, estas etapas incluyen: diafiltración, tratamiento térmico, filtración estéril, llenado en viales y pasteurización final de los viales, antes de someter a cuarentena dichos viales, por lo general, durante un período no menor de 14 días a 30-32°C, con el fin de asegurar la esterilidad del producto final.

Los presentes inventores han descubierto que durante el proceso de obtención de una solución de albúmina a partir de plasma humano, la albúmina sufre modificaciones en el estado redox de Cys-34. Estas modificaciones se producen fundamentalmente durante el almacenamiento en presencia de oxígeno, por lo que se detectan fundamentalmente después de la etapa de cuarentena. Se ha encontrado en varios lotes de producción (n=7) que los niveles de HMA, HNA1 y HNA2 son de 40-53%, 39-44% y 7-16% (p/v), respectivamente, y, por lo tanto, principalmente los niveles de HMA y HNA2 difieren de los descritos en personas sanas saludables (Oettl K. 2008, 2010 y 2013, citados anteriormente). Esto podría tener significativa importancia, por ejemplo, en el caso de HNA2, ya que la oxidación a HNA2 resulta en un proceso irreversible, tal como se mencionó anteriormente.

Sorprendentemente, los inventores han descubierto que mediante la adición de una etapa en el proceso de producción de una solución de albúmina humana, que comprende la reducción del oxígeno disuelto en la solución en la que se reduce el nivel de oxígeno hasta una concentración igual o menor que 0,5 ppm, se logra reducir la oxidación de Cys-34, obteniéndose un estado redox de la albúmina que es muy similar al estado redox que presenta la albúmina en el plasma sanguíneo. Esto hace que las propiedades de la albúmina obtenida, por ejemplo, sus propiedades antioxidantes sean más parecidas a las de la albúmina presente en la sangre y que pueda dar lugar a una mejora de su eficacia terapéutica en muchas de sus aplicaciones.

Por lo tanto, la presente invención da a conocer un procedimiento de preparación de una solución de albúmina humana caracterizado porque comprende una etapa de reducción del oxígeno disuelto en dicha solución de albúmina en la que el nivel de oxígeno se reduce hasta una concentración igual o menor que 0,5 ppm. Preferentemente después de la etapa de reducción del oxígeno disuelto en la solución de albúmina, dicha solución de albúmina se mantiene en una atmósfera de gas inerte.

Dicha etapa de reducción del oxígeno disuelto en la solución de albúmina se puede llevar a cabo de varias maneras conocidas en la técnica. Preferentemente, se puede realizar un tratamiento superficial de la solución de albúmina con un gas inerte o burbujeando un gas inerte en el interior de dicha solución de albúmina. Dicho gas inerte utilizado en el procedimiento de la presente invención puede ser nitrógeno, helio o similares.

El procedimiento de la presente invención se puede utilizar para la obtención de soluciones de albúmina que presenten una concentración de albúmina entre 4 y 25% (p/v) aproximadamente. Preferentemente, la albúmina obtenida es albúmina terapéutica.

Además, la albúmina de la presente invención puede ser albúmina obtenida de forma recombinante o de forma transgénica. La molécula de albúmina recombinante o transgénica es idéntica a la humana en cuanto a su secuencia de aminoácidos, no presenta glicosilación y, para que sea funcional, tiene que presentar el mismo plegamiento conformacional que la albúmina de origen plasmástico humano. Si no fuese así, no podría ser administrada a humanos por el riesgo de inmunogenicidad, entre otros posibles efectos adversos causados por dichas diferencias.

La etapa de reducción del oxígeno disuelto en...

1. Procedimiento de preparación de una solución de albúmina humana caracterizado porque comprende una etapa de reducción del oxígeno disuelto en dicha solución de albúmina en la que el nivel de oxígeno se reduce hasta una concentración igual o menor que 0,5 ppm.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de reducción del oxígeno disuelto en la solución de albúmina se lleva a cabo realizando un tratamiento superficial de la solución de albúmina con un gas inerte.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de reducción del oxígeno disuelto en la solución de albúmina se lleva a cabo burbujeando un gas inerte en el interior de dicha solución de albúmina.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la albúmina es de origen plasmático, recombinante o transgénico

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la solución de albúmina presenta una concentración de albúmina entre 4 y 25% (p/v).

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque el gas inerte utilizado es nitrógeno o helio.

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la etapa de reducción del oxígeno disuelto en la solución de albúmina se realiza antes de una etapa de pasteurización de dicha solución de albúmina.

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la etapa de reducción del oxígeno disuelto en la solución de albúmina se realiza después de una etapa de pasteurización de dicha solución de albúmina.

9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque después de la etapa de reducción del oxígeno disuelto en la solución de albúmina, dicha solución de albúmina se mantiene en una atmósfera de gas inerte.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, caracterizado porque la atmósfera de gas inerte es de gas de nitrógeno o helio.

11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la 5 solución de albúmina se envasa y/o almacena en un recipiente fabricado de un material

impermeable al oxígeno.

12. Procedimiento, según la reivindicación 11, caracterizado porque el material impermeable al oxígeno es vidrio.

13. Composición que comprende albúmina humana preparada mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque presenta una concentración de oxigeno disuelto igual o menor que 0,5 ppm.

14. Uso de una composición que comprende albúmina, según la reivindicación 13, para la

preparación de un medicamento.