PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE CARACTERÍSTICAS Y/O PARA LA CLASIFICACIÓN DE MACRÓFAGOS CIRCULANTES Y SISTEMA DE ANÁLISIS PARA LLEVAR A CABO DICHO PROCEDIMIENTO.

Procedimiento para la determinación de características y/o la clasificación de macrófagos circulantes,

que incluye los siguientes pasos: - aislamiento de macrófagos de sangre total mediante centrifugación por gradiente; - perforación de las células macrófago; - tinción intracelular de las células con al menos un anticuerpo seleccionado; y - análisis por citometría de flujo de las células previamente tratadas, con evaluación estadística subsiguiente de varias células

La invención se refiere a un procedimiento para la determinación de características y/o para la clasificación de macrófagos circulantes mediante antígenos no propios de la célula y a un sistema de análisis para llevar a cabo un procedimiento de este tipo.

10 Por la publicación de Sinha, Wilson, Gleason: Immunoelectron microscopic localization of prostaticspecific antigen in human prostate by the protein A-gold complex, Cancer, 1987, 60, 1288-91, se conoce un método consistente en realizar un análisis por microscopía electrónica de células de tejido prostático. De acuerdo con dicha referencia bibliográfica, se incubó tejido normal de próstata, tejido de carcinoma de próstata y tejido hiperplásico de próstata con anticuerpos PSA marcados con oro. Los análisis mostraron que las partículas de oro se encontraban en el citoplasma, en los gránulos intracelulares, RES y lisosomas. Cuanto mayor es la desdiferenciación de un tumor, más partículas de oro aparecen en estructuras membranares. Esto se evaluó como una señal de que, con una desdiferenciación creciente de las células tumorales, el PSA (antígeno prostático específico) se depositaba en las estructuras de membrana. Otro aspecto de dicho estudio consistió en que también se detectaron partículas de oro en granulocitos y macrófagos.

En análisis por citometría de flujo se encontraron células en sangre 25 circulante que eran PSA positivas. Sin embargo, en los análisis previamente conocidos sólo se tiñeron para PSA las superficies de los macrófagos.

El hecho de que no se encontrara ningún ARNm de la molécula de PSA en los macrófagos sólo permite concluir que únicamente se absorbe la molécula de PSA y que no se trata de la eliminación de micrometástasis. A este respecto véase Brandt, Griwatz, Brinkmann: Circulating prostate-specific antigen/CD14double-positive cells; a blomarker indicating low risk for hematogeneous metastasis of prostate cancer, J.Natl. Cancer Inst. 1997; 89, 174.

Como es sabido, las transformaciones malignas de células tisulares agrupadas en un agrupamiento celular más o menos ordenado se denominan tumor. Estas células tumorales no respetan el orden de los tejidos, crecen sin impedimentos y se expanden aumentando de tamaño e infiltrándose en tejidos vecinos, órganos, o crecen a través de los límites del órgano llegando a la corriente sanguínea y al sistema linfático.

Cuando un tumor llega a la corriente sanguínea o al sistema linfático, las células individuales o los agrupamientos celulares se pueden desplazar a través de estos sistemas y fijarse en otros lugares del cuerpo en forma de metástasis. Aquí existe el peligro de que las metástasis sigan creciendo y quiten energía al cuerpo hasta que éste finalmente resulte vencido y muera por la enfermedad.

Cuando se desarrolla un tumor de este tipo, las células tumorales producen sustancias que favorecen este crecimiento. Además, se pueden liberar sustancias útiles como indicadores de crecimiento tumoral. Estas últimas se denominan marcadores tumorales. Pero estos marcadores no son específicos de un tumor, sino que únicamente indican la magnitud de la concentración medida en la sangre, ya que las células sanas también pueden liberar este tipo de sustancias. Por ello, los marcadores tumorales no pueden ser utilizados para detectar un tumor, sino únicamente para controlar el desarrollo de la enfermedad o la terapia. Un marcador específico de un tumor es el antígeno prostático específico (PSA), el cual, a partir de una concentración determinada en la sangre, es indicativo de carcinoma de próstata. Sin embargo, un aumento benigno de la próstata también puede provocar un aumento del valor de PSA en sangre.

Hasta ahora, las enfermedades tumorales se diagnostican principalmente mediante procedimientos que proporcionan imágenes, como ultrasonido o tomografía computerizada, mamografía o similares. No obstante, la decisión definitiva sólo se toma después de una muestra de tejido tumoral con determinación del desarrollo de la terapia.

El sistema inmunológico propio del cuerpo humano reacciona contra las enfermedades tumorales. Este sistema inmunológico consiste en una serie de diferentes tipos de células que desempeñan diversas funciones. Entre otros, los macrófagos tienen la misión de reconocer un determinado material patológico y fagocitarlo y descomponerlo en sus diversos componentes. A continuación se presentan fragmentos de las células fagocitadas en la superficie de otros inmunocitos para que éstos tengan la posibilidad de reconocer la estructura contra la que deben actuar.

Existe una necesidad urgente de poder realizar, en un estadio temprano, una determinación de las características de los macrófagos circulantes sin tener que llevar a cabo exámenes directos sobre el cuerpo humano.

El objetivo de la invención consiste en proponer un procedimiento y un sistema de análisis con cuya ayuda sea posible la determinación de las características y/o la clasificación de macrófagos circulantes.

De acuerdo con la invención, se parte de la base de que en los macrófagos circulantes se pueden detectar antígenos o fragmentos de células tumorales fagocitadas y, por consiguiente, se puede llevar a cabo una detección tumoral específica.

De acuerdo con la invención, se lleva a cabo una extracción de sangre total y a continuación una centrifugación por gradiente para aislar los macrófagos. Después, las células macrófago se perforan y se realiza una tinción de las células con al menos un anticuerpo seleccionado.

A continuación se recurre a la citometría de flujo conocida en sí para documentar las características de las células a nivel individual.

La citometría de flujo posibilita el recuento y el análisis de características físicas y moleculares de células en una corriente de líquido. En concreto, con ayuda de muestras marcadas con colorante fluorescente, por ejemplo anticuerpos, se lleva a cabo y se documenta una determinación de las características de células o poblaciones de células a nivel individual.

La base consiste aquí en la reacción antígeno-anticuerpo realizada con anticuerpos marcados con colorante fluorescente. Para el análisis, las células de una suspensión individual pasan, por focalización hidrodinámica, junto a un rayo láser en haz con una longitud de onda adecuada. En caso de una excitación correspondiente de los electrones del colorante fluorescente por el rayo láser monocromático, éstos suben a un nivel de energía superior. Después del pulso láser, los electrones caen de vuelta a su nivel original emitiendo energía en forma de fotones. La concentración de fotones emitida, registrada mediante un fotodetector, es proporcional a la cantidad de anticuerpos unidos por célula. Además, mediante difracción y dispersión de la luz se obtiene información sobre el tamaño de la célula y de la estructura interior, es decir, la granularidad del citoplasma, el tamaño del núcleo celular, etc.

Como anticuerpos seleccionados se utilizan antígenos prostáticos específicos, anticuerpos de citoqueratina y/o antígeno de membrana epitelial.

Por consiguiente, de acuerdo con la invención, mediante la tinción del anticuerpo de PSA en los macrófagos se puede determinar si el material fagocitado es relevante para la próstata.

El sistema de análisis para la realización del procedimiento incluye medios para heparinizar la sangre extraída, una centrifugadora por gradiente para el aislamiento de macrófagos, medios de perforación celular, un dispositivo para la tinción intracelular con anticuerpos fluorocromados de las células previamente tratadas y un citómetro de flujo con unidad de evaluación asistida por ordenador para determinar la estructura intracelular de la célula previamente tratada y aislada en cada caso para una detección tumoral temprana.

La invención se explica más detalladamente a continuación por medio de un ejemplo de realización.

En el paso de la extracción de sangre y tinción se comienza por ejemplo con 6 ml de sangre total, que se someten a heparinización. Con ayuda de la centrifugación por gradiente se lleva a cabo el aislamiento de monocitos, macrófagos y linfocitos.

En el siguiente paso, las células se someten a una fijación con formaldehído y un tratamiento con saponinas para su perforación.

A continuación se lleva a cabo el paso de tinción intracelular con anticuerpos seleccionados, por...

1. Procedimiento para la determinación de características y/o la clasificación de macrófagos circulantes, que incluye los siguientes pasos:

5  aislamiento de macrófagos de sangre total mediante centrifugación por gradiente;

 perforación de las células macrófago;

 tinción intracelular de las células con al menos un anticuerpo seleccionado; y

10  análisis por citometría de flujo de las células previamente tratadas, con evaluación estadística subsiguiente de varias células.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por la utilización de antígeno prostático específico (PSA), citoqueratina y/o antígeno de membrana epitelial como anticuerpo o anticuerpos a seleccionar.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por la evaluación por histogramas del control de isotipos y la tinción una vez realizada la citometría de flujo.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la

detección, fuera del cuerpo humano, de partes de células tisulares de un 20 tumor de próstata propagado absorbidas por fagocitosis.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque a través de la tinción del PSA en los macrófagos se determina si el material fagocitado es relevante para la próstata.