PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE FACTORES BIOLÓGICOS EN LA EPIDERMIS.

Procedimiento para cuantificar la expresión relativa de un ácido ribonucleico (ARN) de una muestra de piel obtenida mediante la aplicación de una cinta adhesiva a la piel y proceder a la abrasión de la piel para obtener una muestra de la adhesión a la cinta,

en el que el ARN codifica una citocina, que comprende: (a) detectar el ARN que codifica una citocina de la muestra de piel; y (b) comparar el nivel de dicho ARN de la muestra de piel con una muestra de control, cuantificando de este modo la expresión relativa de dicho ARN

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US1999/019012.

Solicitante: DERMTECH INTERNATIONAL.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 15222-B AVENUE OF SCIENCE SAN DIEGO, CA 92128 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: RHEINS,Lawrence,A, MORHENN,Vera,B.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 17 de Agosto de 1999.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K49/00H4
  • C12Q1/68A4
  • C12Q1/68M6

Clasificación PCT:

  • A61K35/36 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 35/00 Preparaciones medicinales que contienen sustancias de constitución indeterminada o sus productos de reacción. › Piel; Sistema piloso; Uñas; Glándulas sebáceas; Cerumen; Epidermis; Células epiteliales; Queratinocitos; Células de Langerhans; Células del ectodermo (islotes de Langerhans A61K 35/39).
  • A61K38/20 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Interleuquinas.
  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/68 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

Clasificación antigua:

  • A61K35/36 A61K 35/00 […] › Piel; Sistema piloso; Uñas; Glándulas sebáceas; Cerumen; Epidermis; Células epiteliales; Queratinocitos; Células de Langerhans; Células del ectodermo (islotes de Langerhans A61K 35/39).
  • A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
  • A61K49/00 A61K […] › Preparaciones para examen in vivo.
  • C12N15/09 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/10 C12N 15/00 […] › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12N15/12 C12N 15/00 […] › Genes que codifican proteínas animales.
  • C12N15/19 C12N 15/00 […] › Interferones; Linfoquinas; Citoquinas.
  • C12N15/24 C12N 15/00 […] › Interleuquinas.
  • C12P19/30 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Nucleótidos.
  • C12P19/34 C12P 19/00 […] › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
  • C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2358175_T3.pdf

 

PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE FACTORES BIOLÓGICOS EN LA EPIDERMIS.
PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE FACTORES BIOLÓGICOS EN LA EPIDERMIS.

Fragmento de la descripción:

Campo técnico 5

La presente invención se refiere a un procedimiento de detección de factores biológicos en la epidermis, en el que el factor biológico puede ser un polinucleótido o polipéptido codificado por el polinucleótido o un lípido.

Antecedentes 10

Las células y los tejidos se ven influidos por agentes endógenos y exógenos y responden con una cascada de actividades biológicas para proporcionar una respuesta a un agente. Por ejemplo, la piel es la zona donde se producen muchas reacciones dermatológicas provocadas por la exposición de la piel a agentes exógenos. La piel es asimismo el órgano más accesible del organismo. Por lo tanto, la propia piel se presta a acceder a la determinación 15 de reacciones proteicas, así como, el / los gen(es) y productos génicos que están asociados con o que dan lugar a una reacción particular.

La epidermis es la capa más externa de la piel. Dicha capa contiene cuatro tipos principales de células. La célula de mayor predominio en la epidermis es el queratinocito en diversas etapas de diferenciación. La epidermis mantiene 20 su grupo de queratinocitos mediante la mitosis de dichas células en la capa celular basal, la capa inferior de la epidermis. En cambio, la capa de recubrimiento superior de la epidermis es la capa córnea que, en la piel normal, no contienen células nucleadas. Los queratinocitos producen una serie de citocinas tales como las interleucinas (IL) IL-I, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 y el factor estimulante de colonias de granulocitos - macrófagos (GM-CSF) Kupper, M., 1993. Am. J Dermatopathol 11: 69-73). Por encima de la capa celular basal, se encuentra el de células 25 de Langerhans, una célula inmunitaria competente que se origina en la médula ósea. La célula de Langerhans presenta características de los macrófagos así como de los linfocitos T y se considera responsable de iniciar una serie de eventos que conducen a reacciones inmunitarias de la piel tales como la dermatitis de contacto. El melanocito es la célula productora de pigmentos de la piel. Dicha se encuentra habitualmente asimismo en las capas más profundas de la epidermis. El cuarto tipo de célula de la epidermis es la célula de Merkel. 30

Inmediatamente debajo de la epidermis, se encuentra la capa dérmica que contiene principalmente fibroblastos, linfocitos, mastocitos, células endoteliales y terminaciones nerviosas. Los fibroblastos son el tipo principal de célula que deposita el material de la matriz extracelular y las proteínas estructurales de la piel, tales como el colágeno. Las células endoteliales recubren las luces de los capilares dérmicos y los mastocitos contienen histamina que se puede 35 liberar en las respuestas inflamatorias de la piel.

La inflamación de la piel puede ser el resultado de una amplia gama de agentes externos aplicados a la piel. Las clases de dermatitis de contacto comprenden mecanismos irritativos, alérgicos, fotoalérgicos y fototóxicas y subclínico. Desde un punto de vista clínico, las reacciones son prácticamente idénticas con la aparición de un 40 proceso eccematoso caracterizado por eritema, edema y vesiculación (Hoefakker et al. 1995 Contact Dermat 33: 258-266; Krasteva, M. 1993 Int. J. Dermatol 32: 547-560). La urticaria de contacto es una respuesta potencial adicional a la aplicación cutánea de diversos agentes que se diferencia en la aparición inmediata de una roncha al entrar en contacto con la piel. Resulta importante para los pacientes categorizar el mecanismo de la reacción de contacto. Ello se debe a las consecuencias inmunológicas de una reacción alérgica o inmunitaria que provoque una 45 inflamación cada vez más grave de la piel con la reexposición tras la sensibilización. Por ejemplo, la caracterización del tipo de respuesta inflamatoria a la exposición de un agente puede permitir tanto a los pacientes como a los fabricantes la posibilidad de adquirir y rediseñar sus productos para evitar futuras reacciones inflamatorias.

La frecuencia y el historial de la dermatitis de contacto han proporcionado el impulso para aplicar las pruebas en la 50 piel humana de todos los nuevos medicamentos tópicos o productos cosmeticéuticos. Se requiere actualmente realizar un gran número de pruebas de seguridad de la piel antes de cualquier producto destinado a entrar en contacto con la piel se pueda comercializar en muchos países. Las pruebas predictivas con parches cutáneos con el producto y sus constituyentes han constituido la base de este procedimiento de prueba. Desde el inicio de estas pruebas predictivas con parche cutáneos, un problema importante ha sido la incapacidad de diferenciar claramente 55 una dermatitis de contacto irritativa (ICD) de una dermatitis de contacto alérgica (ACD). Además, la prueba con parches simplemente no resulta suficiente para determinar cuantitativamente la gravedad de una reacción ya que depende de puntuaciones cualitativas visuales del eritema, el edema y la vesiculación.

Constituye un objetivo de la presente invención superar las limitaciones descritas anteriormente. Por lo tanto, la 60 presente invención proporciona un procedimiento no invasivo para detectar un factor biológico en las células cutáneas por debajo del estrato córneo. La caracterización del factor biológico resulta útil para distinguir las reacciones sistémicas así como las reacciones locales tales como la dermatitis de contacto y, más específicamente, para distinguir la dermatitis de contacto irritativa (ICD) de la dermatitis de contacto alérgica (ACD).

65

La presente invención proporciona un procedimiento para cuantificar la expresión relativa de un ácido ribonucleico (ARN) de una muestra de piel obtenida mediante la aplicación de una cinta adhesiva a la piel y proceder a la abrasión de la piel para obtener una muestra adherida a la cinta adhesiva, en la que el ARN codifica una citocina, que comprende:

5

(a) detectar el ARN que codifica una citocina de la muestra de piel; y

(b) comparar el nivel de dicho ARN de la muestra de piel con una muestra de control, cuantificando de este modo la expresión relativa de dicho ARN.

Se puede diagnosticar la ICD en un paciente mediante la cuantificación del polinucleótido que codifica la IL-8 en las 10 células del subestrato córneo del paciente, en las que la presencia del ARNm de la IL-8 en una ausencia relativa de IL -4 y IL-13 es indicativa de la ICD.

Se puede diagnosticar la ACD en un paciente mediante la cuantificación del polinucleótido que codifica la IL-4 a partir de células del subestrato córneo del paciente, en las que la presencia del ARNm de la IL-4 es indicativa de la 15 ACD.

Se puede diagnosticar asimismo la ACD detectando la expresión de la IL-13 en un paciente comprendiendo la cuantificación de un polinucleótido que codifica la IL-13 en células cutáneas del paciente, en las que una cantidad elevada del polinucleótido de la IL-13 es indicativa de la ACD. 20

Un kit para obtener muestras de la piel de un modo no invasivo puede comprender una cinta para la recogida de células y una zona intermedia de lisis celular o un chip informático apto para conservar los ácidos nucleicos de la muestra de piel.

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Alternativamente, un kit puede comprender una cinta para la recogida de células y una zona intermedia de lisis celular y un reactivo de detección, tal como un reactivo de hibridación.

Se puede identificar un compuesto que provoca dermatitis mediante el contacto con una sección de la piel con un compuesto de ensayo y, posteriormente, detectar la presencia de un polinucleótido que codifica una citocina o un 30 polipéptido de una citocina, siendo la presencia del polinucleótido indicativa de una dermatitis. El procedimiento se puede realizar in vivo o in vitro, comprendiendo la utilización de constructos cutáneos organotípicos tridimensionales.

Los detalles de una o más formas de realización de la presente invención se establecen en los dibujos adjuntos y la descripción posterior. Otras características, objetivos y ventajas de la presente invención se pondrán claramente de 35 manifiesto a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

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Reivindicaciones:

1. Procedimiento para cuantificar la expresión relativa de un ácido ribonucleico (ARN) de una muestra de piel obtenida mediante la aplicación de una cinta adhesiva a la piel y proceder a la abrasión de la piel para obtener una muestra de la adhesión a la cinta, en el que el ARN codifica una citocina, que comprende: 5

(a) detectar el ARN que codifica una citocina de la muestra de piel; y

(b) comparar el nivel de dicho ARN de la muestra de piel con una muestra de control, cuantificando de este modo la expresión relativa de dicho ARN.

10

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra de piel comprende las células del estrato córneo y las células asociadas al estrato córneo que se han obtenido al aplicar y retirar de la cinta adhesiva.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la detección comprende detectar ARNm.

15

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección comprende detectar un ARN que codifica una interleucina.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la detección comprende detectar un ARN que codifica la interleucina-I (IL-I), la interleucina-2 (IL-2), la interleucina-3 (IL-3), la interleucina-4 (IL-4), la interleucina-5 (IL-5), la 20 interleucina-6 (IL-6), la interleucina-8 (IL-8), la interleucina-9 (IL-9), la interleucina-13 (IL-13) y la interleucina-14 ( IL-14), el factor estimulante de colonias de granulocitos - macrófagos (GM-SCF) o un interferón, o cualquier combinación de los mismos.

6. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la detección comprende detectar un ARN que codifica una 25 sustancia que interviene en la inflamación.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cinta adhesiva se aplica a la piel de un paciente afectado por una enfermedad, trastorno o reacción inflamatoria.

30

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la cinta adhesiva se aplica a la piel de un paciente afectado por dermatitis.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cinta adhesiva se aplica a piel que ha puesto en contacto con un agente externo que provoca dermatitis antes de aplicar la cinta. 35

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra de piel se obtiene de un mamífero.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra de piel se obtiene de un ser humano.


 

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