PARTÍCULAS.

La presente invención se refiere a partículas. Más concretamente, se refiere al desensamblaje y/o al ensamblaje selectivo de agregados de nanopartículas como respuesta a enzimas. En ciertos aspectos, el desensamblaje de agregados de nanopartículas como respuesta a enzimas se usa en el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades. Recientemente, se han hecho grandes esfuerzos por investigar el ensamblaje y desensamblaje controlados de nanopartículas inorgánicas para generar nuevos materiales y dispositivos potencialmente útiles para la detección, la catálisis, el transporte y otras aplicaciones en Medicina e Ingeniería (Niemeyer, Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 4128). Estos nanomateriales ajustables y/o conmutables pueden tener ciertas aplicaciones médicas, tales como la biodetección y la administración de fármacos. Para tales aplicaciones, sería valiosa la capacidad de ensamblar y desensamblar dinámicamente tales estructuras, como la producida por condiciones ambientales fisiológicamente accesibles (Stevens, et al, advanced Materials, 2004 16, 915). Hay estudios previos que han descrito el uso de sistemas de ADN de reconocimiento biomolecular muy específicos, el sistema de estreptavidina/biotina y sistemas de anticuerpo/antígeno para dirigir el (des)ensamblaje de nanopartículas (Mirkin, et al, Nature 1996, 382, 607; Rosi y Mirkin, Chem. Rev., 2005, 105, 15471562; Katz y Willner, Angewandte Chemie, 2004, 43, 60426108). Estos sistemas tienen un enorme potencial como herramientas de diagnóstico, pues son sensibles, dan una respuesta rápida, no dependen de un equipamiento especializado y son compatibles con las condiciones biológicas. Los estímulos que se pueden usar para (des)ensamblar nanoestructuras incluyen la temperatura, la polaridad del disolvente, la concentración iónica (incluyendo el pH), campos eléctricos o magnéticos ligeros. Estos estímulos habitualmente afectan al microambiente y, por tanto, no siempre son compatibles con los fluidos biológicos. La mayoría de las interacciones biológicas sólo pueden soportar fluctuaciones ambientales bastante ligeras. Recientemente, se ha descrito una serie de sistemas que aprovechan la acción catalítica de las enzimas para controlar el estado ensamblado de las nanopartículas con aplicaciones en biodetección. En estos sistemas, se modifica la superficie de las nanopartículas con moléculas sensibles a enzimas que pueden formar interacciones covalentes o no covalentes con grupos ligados situados sobre nanopartículas vecinas. Cuando lo desencadena una enzima, se puede producir el ensamblaje o desensamblaje de nanopartículas. Zhao et al usaron un enfoque con nanopartículas magnéticas como interruptores magnéticos de relajación para detectar la actividad proteasa (Zhao, et al, Angew. Chem., Int. Ed, 2003, 42, 13751378). En este enfoque, las secuencias sensibles a la proteasa estaban flanqueadas en ambos terminales por moléculas de biotina, mientras que las nanopartículas estaban revestidas de avidina. En este enfoque, la acción enzimática es seguida por la adición separada de nanopartículas. Como tal, actualmente no se presta a una monitorización en tiempo real de la acción enzimática. Kanaras et al. demostraron que es posible usar una serie de enzimas de restricción y unión del ADN para ensamblar diferentes poblaciones de nanopartículas de oro revestidas de ADN (Kanaras, et al, Angew. Chem., Int. Ed., 2003, 42, 191194). En este enfoque, se necesitan dos o más poblaciones separadas de nanopartículas. En el documento WO 02/098364, Manuel Perez et al., Nature Biotechnology, 2002, 20, 816820 y en Manuel Perez et al., Chem BioChem 2004, 5, 261264, se describen más conjugados de nanopartículas magnéticas. El documento WO 2005/100602 describe un ensamblaje de nanopartículas que comprende conectores de polinucleótidos. Chang et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 334 (2005), 13171321 revela sondas de puntos cuánticos activadas por proteasas. Los presentes inventores han descubierto una estrategia para el ensamblaje/desensamblaje reversible de agregados de nanopartículas que es producido por reacciones enzimáticas y, por tanto, se puede aplicar a fluidos biológicos. En un primer aspecto, la presente invención proporciona un agregado de nanopartículas que comprende nanopartículas ligadas a otras nanopartículas indirectamente por medio de un resto de unión de fluorenilmetoxi carbonilo (Fmoc), en el que las nanopartículas están ligadas al resto de unión de Fmoc mediante conectores peptídicos que son capaces de ser escindidos por una enzima proteasa, en el que la escisión de los conectores peptídicos por la enzima proteasa da como resultado un resto de repulsión que se revela sobre las nanopartículas, que aumenta el desensamblaje del agregado de nanopartículas debido a la repulsión entre los restos de repulsión. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para formar un agregado de nanopartículas del primer aspecto que comprende: ligar nanopartículas a otras nanopartículas indirectamente por medio de un resto de unión de fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), en el que las nanopartículas son ligadas al resto de unión de Fmoc mediante conectores peptídicos que son capaces de ser escindidos por una enzima proteasa para dejar ver un resto de repulsión. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una nanopartícula acoplada a un resto de unión de fluorenil metoxicarbonilo (Fmoc) mediante un conector peptídico que puede ser escindido por una enzima proteasa para dejar ver un resto de repulsión. 2 ES 2 365 536 T3 La escisión del conector por parte de la enzima puede ser reversible o irreversible. Las características preferidas de cada aspecto de la invención se exponen en la presente memoria en las reivindicaciones dependientes. La presente invención se describirá más detalladamente con referencia a las figuras no restrictivas anexas, en las que: La Figura 1 ilustra un agregado de partículas según la presente invención y cómo puede ser desagregado por una proteasa, la termolisina; la Figura 2a es una imagen de microscopio electrónico de transmisión de un agregado de nanopartículas ensambladas según la presente invención y la Figura 2b es una imagen de microscopio electrónico de transmisión del agregado de nanopartículas tras la exposición a una enzima; la Figura 3 ilustra dos enfoques diferentes para el desensamblaje enzimático de las nanopartículas. El Enfoque 1 es según la presente invención y el Enfoque 2 no es según la presente invención; la Figura 4 ilustra cómo se puede usar el ensamblaje y desensamblaje de agregados de nanopartículas según la presente invención para rastrear la especificidad de las enzimas; la Figura 5 ilustra las constantes de equilibrio del ensamblaje reversible de nanopartículas según la invención; la Figura 6 es una tabla que describe las proteasas implicadas en la cicatrización de heridas; la Figura 7A ilustra un agregado de nanopartículas según la presente invención y cómo puede ser desensamblado por una proteasa, la termolisina; la Figura 7B es una imagen de microscopio electrónico de transmisión (TEM) de 8,5 nm de nanopartículas de oro a un pH 8 tras la funcionalización con el péptido 1 según lo descrito en el ejemplo de la presente memoria; y la Figura 7C es la imagen de TEM correspondiente tras la adición de la termolisina; la Figura 8A muestra los espectros UVvisible de oro de FmocGlyPheCysNH 2 (línea continua) antes de la adición de enzima y oro de + PheCysNH 2 a las 6 h (línea discontinua) de la adición de termolisina 7,2nM; la Figura 8B es una gráfica de espectros UVvisible que muestra las superficies de la curva que fueron calculadas para todas las muestras; la Figure 8C es una gráfica que representa la proporción de A/D en intervalos de 5 min para concentraciones 7,2nM y 1nM de termolisina; y la Figura 8D es una gráfica que representa {( proporción de A/D)/ t} a las 2 h frente a log [termolisina]; y la Figura 9 es una gráfica que representa el porcentaje del cambio de la intensidad frente al tiempo cuando se añaden 0,45 ng/ml (línea continua) y 1 ng/ml (línea discontinua) de Antígeno Prostático Específico (APE) a un agregado de nanopartículas de oro que se mantiene unido por un péptido capaz de ser escindido por el APE. En la presente invención, las enzimas se usan para controlar la unión entre las partículas y, por tanto, median en el desensamblaje y/o ensamblaje de los agregados de partículas. Las enzimas presentan considerables ventajas frente a los procedimientos químicos convencionales en cuanto a que: son excepcionalmente quimio, regioy enantioselectivas; funcionan en condiciones suaves (p.ej., acuosas, pH 58); pueden catalizar reacciones cerca de superficies in vivo y, por tanto, están bien dotadas para catalizar reacciones en interfases... [Seguir leyendo]

1. Un agregado de nanopartículas que comprende nanopartículas ligadas a otras nanopartículas indirectamente por medio de un resto de unión de fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), en el que las nanopartículas están ligadas al resto de unión de Fmoc mediante conectores peptídicos que son capaces de ser escindidos por una enzima proteasa, en el que la escisión de los conectores peptídicos por la enzima proteasa da como resultado un resto de repulsión revelado sobre las nanopartículas, que aumenta el desensamblaje del agregado de nanopartículas debido a la repulsión entre los restos de repulsión. 2. Un agregado según lo reivindicado en la reivindicación 1, en el que el resto de repulsión es un resto cargado que repele a otros restos de repulsión mediante repulsión electrostática. 3. Un agregado según lo reivindicado en la reivindicación 2, en el que el resto cargado es una amina. 4. Un agregado según lo reivindicado en la reivindicación anterior, en el que la nanopartícula es una nanopartícula de oro. 5. Un agregado según lo reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un fármaco que es liberado cuando los conectores peptídicos son escindidos por la enzima proteasa. 6. Una nanopartícula acoplada a un resto de unión de fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) mediante un conector peptídico que puede ser escindido por una enzima proteasa para revelar un resto de repulsión. 7. Una nanopartícula según lo reivindicado en la reivindicación 6 modificada por las características de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4. 8. Un procedimiento para formar un agregado de nanopartículas según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende: ligar nanopartículas a otras nanopartículas indirectamente por medio de un resto de unión de fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), en el que las nanopartículas son ligadas al resto de unión de Fmoc mediante conectores peptídicos que son capaces de ser escindidos por una enzima proteasa para revelar un resto de repulsión. 9. Un agregado de nanopartículas según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una nanopartícula según lo reivindicado en la reivindicación 6 o la reivindicación 7 para su uso en medicina. 10. El uso de un agregado de nanopartículas según lo reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una nanopartícula según lo reivindicado en la reivindicación 6 o la reivindicación 7 en la elaboración de un diagnóstico para diagnosticar una enfermedad o afección asociada con la enzima proteasa. 11. El uso de un agregado de nanopartículas que comprende nanopartículas ligadas a otras nanopartículas indirectamente mediante un resto de unión de fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), en el que las nanopartículas están ligadas al resto de unión de Fmoc mediante conectores peptídicos que son capaces de ser escindidos por una enzima proteasa para revelar un resto de repulsión y un fármaco, en el que el fármaco es retenido en el agregado hasta que los conectores peptídicos son escindidos por la enzima proteasa, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la enzima proteasa. 13 ES 2 365 536 T3 14 ES 2 365 536 T3 ES 2 365 536 T3 16 Figura 6: Proteasas implicadas en la cicatrización de heridas y su especificidad por el sustrato Proteasas Nombre(s) de la enzima PM (kDa) Sustrato Especificidad por el sustrato pI MMP Otros nombres latente activa 6,47 AcProLeuGlyS~LeuGlyOEt McaProLeuGly~LeuDpaAlaArgNH2 ProMetAla~LeuTrpAlaThr LeuProMet~PheSerPro 52 43 Colágenos (I, II, III, VII, VIII, X, XI); gelatina; agrecano; tenascina, L selectina; IL1ß; proteoglucanos; entactina; ovostatina; MMP2; MMP9 Colagenasas MMP1 Colagenasa1, colagenasa intersticial Familias de MMP AcProLeuAlaS~NvaTrpNH2 183 191 RWTNFREY 6,38 ProGluGly~IleAlaGly ProGluGly~LeuLeuGly GPQG~IWGQ ProLeuGlu/Ala~TyrTrpSer 2,4DNPProGlnGlyIIeAlaGlyDArgOH 75 58 Colágenos (I, II, III, V, VII, VIII y X); gelatina; entactina; agrecano; tenascina, fibronectina, ProMMP1,2 MMP8 Colagenasa2, colagenasa neutrófila ES 2 365 536 T3 5,32 McaProLeuGly~LeuDpaAlaArgNH2 GlyProGlnGly~LeuAlaGlyGLn779 AspValGlyGlu~TyrAsnValPhe88 52 42 Colágenos (I, II, III, IV, IX, X, XIV); gelatina; entactina, agrecano; tenascina, plasminógeno; agrecano; perlecano; fibronectina; fibrinógeno/fibrina; osteonectina; MMP9; ProMMP9,13 MMP13 Colagenasa3, colagenasa intersticial de rata 17 5,26 GPQG~IFGQ McaProLeuGly~LeuTrpAlaArgNH2 AcProLeuAla~ s NvaTrpNH2 ProGlnGly~IIeAlaGlyGln 71 62 Gelatininas; fibronectina; elastina; colágenos (I, IV, V, VII, X, XI); laminina; agrecano; vitronectina; decorina; IGFBP3/5 Gelatinasas MMP2 Gelatinasa A, gelatinasa de 72 kDa, colagenasa de tipo IV Familias de MMP 5,69 GPLG~IAGQ ProLeuGly~MetLeuSerHis 76 67 Colágenos (IV, V, VII, X, XIV, XVII); gelatina; entactina, agrecano; elastina, fibronectina; fibrinógeno/fibrina; osteonectina; plasminógeno; MBP; IL 1beta MMP9 Gelatinasa B, gelatinasa de 92 kDa, colagenasa de tipo V Figura 6: continuación Proteasas Nombre(s) de la enzima PM (kDa) Sustrato Especificidad por el sustrato pI MMP Otros nombres latente activa 5,77 McaRPKPVE~ZWRK(dnp)NH2 52 43 Colágenos (III, IV, V y IX); gelatina; agrecano; perlecano; decorina; laminina; elastina; caesina; osteonectina; ovostatina; entactina; plasminógeno; MBP; IL1beta; MMP 2/TIMP2; MMP7; MMP8; MMP9; MMP13 Estromelisinas MMP3 Estromelisina1, Transina, CAP, proteoglucanasa DnpRPLA~ZWRS, cuando X es igual a: Leu Phe Tyr Trp 5,49 AspValGlyHis~PheSerSerPhe85 GlyProHisLeu~LeuValGluAla29 52 44 Colágenos (IIV); gelatina; caseína, agrecano, entactina; elastina; vitronectina; fibrinógeno/fibrina; laminina, MMP1; MMP8 Estromelisina2, Transina2 Estromelisinas MMP Familias MMP ES 2 365 536 T3 6,25 AlaAlaGlyAla~MetPheLeuGlu354 ArgValGlyPhe~TyrGluSerAsp688 LysAlaLeuHis~ValThrAsnIle144 DnsProLeuAla~Cys(OmeBzI)TrpAla 51 46 Laminina; fibronectina; agrecano; IGFBP1 Estromelisina3, motivo furina MMP 11 ArgNH2 LeuValGluAla~LeuTyr~LeuValCysO3H Gly20 18 8,75 52 20 Colágeno IV; gelatina; elastina; caseína; fibronectina; vitronectina; laminina; entactina; MBP; fibrinógeno/fibrina; plasminógeno Metaloelastasa de macrófagos, metaloelastasa Otras MMP MMP 12 DnpArgProLeuAla~LeuTrpArgSerNH2 ArgProPheGlu~ValLysAspThr203 GlyAlaMetPhe~LeuGluAlaIIe356 28,57806 Elastina MeOSucAlaAlaProValpNa 9,31 Elastasa neutrófila Serina proteasas Colágenos BenzoilPheValArgpNA,HCl Trombina Factor II, coagulación Elastasa 25 Elastina 8,0 8,5 ES 2 365 536 T3 19 ES 2 365 536 T3