PARTICULAS SIMILARES A CORONAVIRUS QUE COMPRENDEN GENOMAS FUNCIONALMENTE SUPRIMIDOS.

Una partícula similar a un virus aislado o recombinante capaz de replicación,

estando dicha partícula derivada de un coronavirus, en donde los genes para las proteínas estructurales no están presentes en el orden 5'-S-E-M-N-3'

Partículas similares a coronavirus que comprenden genomas funcionalmente suprimidos.

La invención se refiere al campo de los coronavirus y diagnosis, al uso terapéutico y a las vacunas derivadas de dichos virus.

Los coronaviriones tienen una estructura bastante simple. Consisten en una nucleocápsida rodeada por una membrana lipídica. La nucleocápsida helicoidal está compuesta por el genoma de RNA empaquetado en un tipo de proteína, la proteína de la nucleocápsida N. La envoltura viral contiene generalmente 3 proteínas de membrana: la proteína de la espícula (S) (correspondiente a la expresión inglesa spike protein, que se emplea en los dibujos), la proteína de membrana (M) y la proteína de envoltura (E). Algunos coronavirus tienen una cuarta proteína en su membrana, la proteína hemaglutinina-esterasa (HE). Como todos los virus los coronavirus codifican una amplia variedad de diferentes productos génicos y proteínas. Las más importantes entre ellos son evidentemente las proteínas responsables de las funciones relacionadas con la replicación viral y la estructura del virión. Pero además de estas funciones elementales los virus especifican generalmente una diversa colección de proteínas cuya función es con frecuencia todavía desconocida, pero que se sabe o supone que de algún modo son beneficiosas para los virus. Estas proteínas pueden ser esenciales -definidas de acuerdo con su función requerida para la replicación del virus en el cultivo celular- o prescindibles. Los coronavirus constituyen una familia de virus grandes de RNA de sentido positivo que provocan generalmente infecciones respiratorias e intestinales en muchas especies diferentes. Basándose en los criterios de proteínas antigénicas, genéticas y estructurales se han dividido en tres grupos distintos: grupo I, II y III. Realmente, en vista de las grandes diferencias entre los grupos su clasificación en tres géneros diferentes está siendo estudiada por el grupo de estudio responsable del International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) [Comité Internacional sobre la Taxonomía de Virus]. Los aspectos que todos estos virus tienen en común son un conjunto característico de genes esenciales que codifican la replicación y las funciones estructurales. Intercaladas entre estos genes y flanqueándolos existen secuencias que difieren profundamente entre los grupos y que son, más o menos, específicas de cada grupo. De los genes elementales el más predominante ocupa aproximadamente dos tercios del genoma. Situado en el extremo 5' y este gen denominado de polimerasa codifica dos precursores grandes cuyos muchos productos de escisión funcional se mantienen colectivamente responsables de la replicación y transcripción del RNA. Los otros genes elementales especifican las proteínas estructurales básicas N, M, E y S. La proteína de la nucleocápsida (N) empaqueta el RNA viral formando el núcleo del virión. Esta estructura de ribonucleoproteína (RNP) está rodeada por una envoltura lipídica en la que abunda la proteína de membrana (M) que constituye una matriz densa. Asociadas a la proteína M están la pequeña proteína de envoltura (E) y la proteína de la espícula (S), formando esta última los peplómeros virales que están implicados en la fusión virus-célula y célula-célula. Los genes de estas proteínas estructurales existen invariablemente en el genoma viral en el orden 5'-S-E-M-N-3'.

En las células infectadas las nucleocápsidas de los coronavirus están ensambladas en el citoplasma. Las nucleocápsidas interaccionan con las proteínas de la envoltura viral que después de su síntesis en el retículo endoplásmico se acumulan en el compartimento intermedio, un sistema de membranas localizado entre el retículo endoplásmico (abreviadamente ER por la expresión inglesa Endoplasmic Reticulum) y el complejo de Golgi. Este sistema de membranas actúa como el compartimento en ciernes: la interacción de las nucleocápsidas con las proteínas de la envoltura viral conduce al desapretamiento de los viriones que a continuación se liberan de la célula por exocitosis.

Los autores del presente invento han demostrado recientemente que el ensamblaje de las partículas coronavirales no requiere la participación de las nucleocápsidas. Las partículas desprovistas de una nucleocápsida se ensamblan en las células cuando los genes de la proteína de la envoltura viral se expresan conjuntamente. Los requisitos mínimos para la formación de partículas similares a virus (abreviadamente en lo sucesivo VLP por la expresión inglesa Virus-Like Particles) son las proteínas M y E: la proteína S es prescindible pero se incorpora si está presente a través de su interacción con la proteína M. Los análisis bioquímicos y por microscopía electrónica revelaron que las VLP tienen un tamaño homogéneo y dimensiones similares a los coronaviriones auténticos. Claramente, las proteínas M y E tienen la capacidad de asociarse en el plano de las membranas celulares e inducir la curvatura que conduce al apretamiento de "vesículas" específicas que posteriormente son secretadas de las células. Un artículo que describe estos resultados ha aparecido en EMBO Journal (vol. 15, pp. 2020-2028, 1996).

Incluso en otro artículo, se mostraron partículas similares a coronavirus que no estaban desprovistas de una nucleocápsida, aquí el ensamblaje no tuvo lugar independientemente de una nucleocápsida (Bos et al., Virology 218, 52-60, 1996). Además, no fue muy eficaz el empaquetamiento del RNA. Por otra parte, ninguna de estas dos publicaciones proporciona suficientes características en cuanto a la dirección a diana y a la administración que harían adecuadas a las VLP como vehículos terapéuticos, por ejemplo equipándolas con información específica sobre la dirección a una diana y/o con un mensaje genético o no genético.

Sin embargo, los coronavirus tienen varias ventajas teóricas distintas para su uso como vectores con relación a otros sistemas de expresión virales (véase también el documento WO98/49195): (i) los coronavirus son virus de RNA monocatenario que se replican en el citoplasma sin un DNA intermediario, haciendo improbable la integración del genoma del virus en el cromosoma de la célula hospedante; (ii) estos virus tienen el mayor genoma de RNA conocido que tiene en principio sitios para la inserción de genes extraños grandes; (iii) puesto que los coronavirus infectan en general las superficies de las mucosas, tanto respiratorias como entéricas, pueden usarse para inducir una fuerte respuesta inmune secretora; (iv) el tropismo de los coronavirus puede modificarse por la manipulación de la proteína de la espícula (S) permitiendo la manipulación del tropismo y la virulencia del vector; y, (v) están disponibles cepas de coronavirus no patógenas que infectan la mayoría de las especies de interés para desarrollar los sistemas de expresión.

Se han desarrollado dos tipos de vectores de expresión basados en los genomas de los coronavirus. Uno requiere dos componentes (dependiente del auxiliar) y el otro un único genoma que se modifica por recombinación dirigida a una diana o por manipulación genética de un cDNA que codifica un RNA infeccioso. Los sistemas de expresión dependientes del auxiliar, denominados también minigenomas se han desarrollado utilizando miembros de los tres grupos de coronavirus. Los coronavirus derivados de los minigenomas tienen una capacidad de clonación teórica próxima a 25 kb, puesto que los RNA minigenómicos de aproximadamente 3 kb son amplificados y empaquetados eficazmente por el virus auxiliar y el genoma del virus tiene aproximadamente 30 kb. Esta es en principio la mayor capacidad de clonación de un vector basado en los genomas de los virus de RNA.

La genética inversa ha sido posible por recombinación dirigida a una diana entre un virus auxiliar y los RNA derivados de coronavirus no replicativos o replicativos (9). La recombinación dirigida a una diana ha sido mediada por uno o dos cruzamientos. Se introdujeron cambios en el gen S que modificaron la patogenicidad del virus de la hepatitis de ratón (abreviadamente en lo sucesivo MHV por la expresión inglesa Mouse Hepatitis Virus). El gen que codifica la proteína verde fluorescente (abreviadamente en lo sucesivo GFP por la expresión inglesa Green Fluorescent Protein) se insertó en el MHV entre los genes S y E por recombinación dirigida a la diana, dando como resultado la creación de un vector con el mayor genoma viral de RNA conocido (1d). También se han producido mutaciones por mutagénesis dirigida en los genes E y...

1. Una partícula similar a un virus aislado o recombinante capaz de replicación, estando dicha partícula derivada de un coronavirus, en donde los genes para las proteínas estructurales no están presentes en el orden 5'-S-E-M-N-3'.

2. Una partícula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde está delecionado al menos un fragmento funcional de un ácido nucleico que codifica un producto de gen viral distinto de una polimerasa o una proteína estructural N, M, E o S.

3. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, provista de al menos una proteína biológicamente activa o uno de sus fragmentos asociada con la superficie de dicha partícula similar a virus distinta del ectodominio natural de una cualquiera de las proteínas del coronavirus original.

4. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, provista de al menos una proteína biológicamente activa o uno de sus fragmentos asociado con el interior de dicha partícula similar a virus distinta del endodominio natural de una cualquiera de las proteínas del coronavirus original.

5. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, provista de al menos medios de diana funcionales asociados con la superficie de dicha partícula similar a virus distintos de la proteína de la espícula natural del coronavirus original.

6. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha partícula está provista de un genoma de coronavirus en donde ha sido insertado un gen extraño o partes del mismo.

7. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que está atenuada.

8. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es un vehículo de administración de genes.

9. Una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es un vehículo de administración de genes o epítopos.

10. Una composición que comprende una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso terapéutico.

11. Una composición que comprende una partícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para uso como vacuna o inmunógeno.

12. Una composición que comprende una particular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en diagnóstico.