Un polinucleótido aislado - que tiene más de 75% de homología con una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:

1 ó 2 o - que codifica una fosfolipasa que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3

Nuevas fosfolipasas y usos de las mismas.

Campo de la invención

La invención se refiere a secuencias de polinucleótidos de nueva identificación que comprenden genes que codifican una nueva fosfolipasa aislada de Aspergillus niger. La invención caracteriza la secuencia de nucleótidos de longitud total de los nuevos genes, comprendiendo la secuencia de cDNA la secuencia codificante de longitud total de la nueva fosfolipasa así como la secuencia de aminoácidos de la proteína funcional de longitud total y equivalentes funcionales de la misma. La invención se refiere también a métodos de utilización de estas enzimas en procesos industriales y métodos de diagnóstico de infecciones fúngicas. Se incluyen también en la invención células transformadas con un polinucleótido de acuerdo con la invención y células en las cuales una fosfolipasa de acuerdo con la invención está modificada genéticamente para aumentar o reducir su actividad y/o nivel de expresión.

Antecedentes de la invención

Los fosfolípidos están constituidos por una cadena principal de glicerol con dos ácidos grasos especificados en una posición exterior (sn-1) y en posición intermedia (sn-2), mientras que el tercer grupo hidroxilo del glicerol está esterificado con ácido fosfórico. El ácido fosfórico puede, a su vez, estar esterificado a por ejemplo un aminoalcohol como etanolamina (fosfatidiletanolamina), colina (fosfatidilcolina). El tercer grupo hidroxilo puede también, en lugar de estar esterificado con ácido fosfórico, estar unido a restos azúcar tales como una galactosa o un dímero de la misma tal como en digalactosildiglicérido.

Las fosfolipasas se definen aquí como enzimas que participan en la hidrólisis de uno o más enlaces en los fosfolípidos que incluyen digalactosildiglicérido descrito arriba.

Pueden distinguirse varios tipos de actividad de fosfolipasa, que hidrolizan el o los enlaces éster que enlazan los restos acilo grasos a la cadena principal del glicerol.

circ La fosfolipasa A₁ (EC 3.1.1.32) y A₂ (EC 3.1.1.4) catalizan la desacilación de un grupo acilo graso en las posiciones sn-1 y sn-2 respectivamente, de un diacilglicerofosfolípido para producir un lisofosfolípido.

circ La lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5 - llamada también fosfolipasa B por el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (Enzyme Nomenclature, Academic Press, Nueva York, 1992))

circ cataliza la hidrólisis del grupo acilo graso restante en un lisofosfolípido. Ha sido dada a conocer una fosfolipasa B de Penicillium notatum (Saito et al., 1991, Methods in Enzymology 197:446-456), que cataliza la desacilación de ambos ácidos grasos de un diacilglicerofosfolípido y posee intrínsecamente actividad de lisofosfolipasa.

circ La galactolipasa (EC 3.1.4.3) cataliza la hidrólisis de uno o los dos grupos acilo grasos en las posiciones sn-1 y sn-2 respectivamente, de un digalactosildiglicérido.

La fosfolipasa C (EC 3.1.4.3) hidroliza el enlace éster fosfato entre la cadena principal de glicerol y el grupo fosfato, por ejemplo:

Fosfatidilcolina + H₂O = 1,2-diacilglicerol + fosfato de colina.

La fosfolipasa D (EC 3.1.4.4) hidroliza el enlace éster fosfato entre el grupo fosfato y el aminoalcohol, por ejemplo: fosfatidilcolina + H₂O = colina + ácido fosfatídico.

Las fosfolipasas pueden producirse convenientemente en microorganismos. Las fosfolipasas microbianas están disponibles de una diversidad de fuentes; las especies Bacillus son una fuente común de enzimas bacterianas, en tanto que las enzimas fúngicas se producen comúnmente en especies de Aspergillus.

Se han publicado enzimas fúngicas con actividad de fosfolipasa procedentes de diversas fuentes, que incluyen Cryptococcus neoformans (Chen et al, 1997, Infection and Immunity 65:405-411), Fusobacterium necrophorum (Fifis et al, 1996, Veterinary Microbiology 49:219-233), Penicillium notatum (conocido también como Penicillium chrysogenum; Kawasaki, 1975, Journal of Biochemistry 77:1233-1244; Masuda et al., 1991, European Journal of Biochemistry 202:783-787), Penicillium cyclopium (Mustranta et al, 1995, Process Biochemistry 30:393-401), Saccharomyces cerevisiae (Ichimasa et al, 1985, Agric. Biol. Chem. 49:1083-1089; Paultauf et al, 1994, J. Biol. Chem. 269:19725-19730), Torulaspora delbrueckii (conocido anteriormente como Saccharomyces rosei, Kuwabara, 1988, Agric. Biol. Chem. 52:2451-2458; Watanabe et al, 1994, REMS Microbiological Letters 124:29-34), Neurospora crassa (Chakravarti et al, 1981, Archives of Biochemistry and Biophysics 206:393-402), Aspergillus niger (Technical Bulletin, G-zyme^TM G6999, Enzyme BioSystems Ltd.; Mustranta et al., 1995, supra), Corticium centrifugum (Uehara et al, 1979, Agric. Biol. Chem. 43:517-525), Fusarium oxysporum (WO 98/26057), y Fusarium solani (Tsung-Che et al., 1968, Phytopathological Notes 58:1437-38).

Genes de fosfolipasas fúngicas han sido clonados de varias fuentes que incluyen Penicillum notatum (Masuda et al., 1991, supra), Torulaspora delbrueckii (Watanabe et al., 1994, FEMS Microbiology Letters 124: 29-34), Saccharomyces cerevisiae (Lee et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 19725-19730), Aspergillus (JP 10155493), Neurospora crassa (EMBL 042791), y Schizosaccharomyces pombe (EMBL O13857).

Las fosfolipasas pueden utilizarse en una multiplicidad de aplicaciones industriales, que incluyen la modificación de emulsionantes fosfolipídicos. Un ejemplo de un emulsionante fosfolipídico es la lecitina, que es una mezcla de lípidos polares y neutros en la cual el contenido de lípidos polares es al menos 60%. Los emulsionantes fosfolipídicos tienen muchas aplicaciones alimentarias y no alimentarias; por ejemplo la lecitina de huevo se utiliza como emulsionante, verbigracia en productos lácteos, específicamente mayonesa, aderezos, repostería, etc.; la lecitina de soja, por ejemplo, se utiliza v.g. como emulsionante en salsas (bajas en calorías), pan, margarina, cosméticos etc., y otras lecitinas se utilizan por ejemplo en bombones, y en piensos de terneros. La modificación de emulsionantes fosfolipídicos por fosfolipasas puede causar una emulsificación incrementada de la mezcla aceite/agua. La modificación de los emulsionantes fosfolipídicos por las fosfolipasas puede aumentar la estabilidad de las emulsiones que resultan de la adición de los emulsionantes fosfolipídicos modificados en un intervalo de pH y/o temperatura más amplio o diferente. La modificación de los emulsionantes fosfolipídicos por las fosfolipasas puede aumentar la estabilidad de las emulsiones resultantes de la adición de emulsionantes fosfolipídicos modificados, en presencia de iones Ca²⁺ o Mg²⁺.

Otro ejemplo de aplicación industrial de las fosfolipasas es que las mismas pueden utilizarse para el desgomado de aceites vegetales en el procesamiento de estos aceites. En un proceso de desgomado típico, las lecitinas se eliminan de los aceites vegetales, por ejemplo aceites de soja, aceites de colza (canola), aceites de linaza, aceites de girasol, para aumentar entre otras cosas la estabilidad del aceite vegetal, por lavado de la fase de aceite con agua, en donde la mezcladura del agua y el aceite en condiciones de cizallamiento alto fuerza la mayor parte de las lecitinas a pasar a la fase acuosa, que se elimina subsiguientemente en un separador. En esta denominada fase de desgomado con agua, únicamente se eliminan con facilidad los fosfolípidos que se hidratan rápidamente, por ejemplo fosfatidilcolina, fosfatidilinositol y fosfatidiletanolamina. Los fosfolípidos/fosfátidos no hidratables, principalmente los fosfolípidos, que están constituidos por hasta 50% de sales de magnesio y/o calcio, no pueden separarse fácilmente en el paso de desgomado con agua. La exposición de los fosfolípidos/fosfátidos no hidratables a fosfolipasa A₂ hace que estos fosfolípidos se vuelvan más solubles en agua y por consiguiente más fáciles de extraer en una fase de desgomado con agua. Otro ejemplo de aplicación industrial de las fosfolipasas es la utilización de las mismas para separar el precipitado que se produce durante la sacarificación (con ayuda de α-amilasa...

1. Un polinucleótido aislado

- que tiene más de 75% de homología con una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 ó 2 o

- que codifica una fosfolipasa que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.

2. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 obtenible a partir de un hongo filamentoso.

3. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 2 obtenible a partir de Aspergillus niger.

4. Un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 2.

5. Un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.

6. Un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha secuencia de polinucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 está enlazada operativamente con secuencias reguladoras adecuadas para expresión de dicha secuencia de polinucleótidos en una célula hospedadora adecuada.

8. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha célula hospedadora adecuada es un hongo filamentoso.

9. Un método para fabricación de un polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1-5 o un vector de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8 que comprende los pasos de cultivar una célula hospedadora transformada con dicho polinucleótido o dicho vector y aislar dicho polinucleótido o dicho vector de dicha célula hospedadora.

10. Una fosfolipasa aislada

- con una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o

- con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.

11. Una fosfolipasa aislada de acuerdo con la reivindicación 10 obtenible a partir de Aspergillus niger.

12. Un método para fabricación de una fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 que comprende los pasos de transformar una célula hospedadora adecuada con un polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 o un vector de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8, cultivar dicha célula en condiciones que permiten la expresión de dicho polinucleótido y purificar opcionalmente el polipéptido codificado a partir de dicha célula o medio de cultivo.

13. Una célula hospedadora recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 o un vector de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8 o que expresa un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11.

14. Anticuerpos purificados reactivos con una fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11.

15. Proteína de fusión que comprende una secuencia de fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11.

16. Un proceso para la producción de masa que comprende añadir una fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11.

17. Un proceso para la producción de un producto horneado a partir de una masa como se prepara por el proceso de la reivindicación 16.

18. Uso de una fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 para la preparación de una masa y/o el producto horneado de la misma.

19. Uso de una fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 para hidrolizar un fosfolípido o para obtener productos de escisión específicos del mismo.

20. Un proceso para reducir el contenido de fosfolípidos en aceite comestible por tratamiento del aceite con un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 para hidrolizar una mayor parte del fosfolípido y separar una fase acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizado del aceite.

21. Un método para diagnosticar si un cierto organismo está infectado con Aspergillus, que comprende los pasos de:

- aislar una muestra biológica de dicho organismo que se sospecha está infectado con Aspergillus

- hacer reaccionar dicha muestra biológica con anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 14

- determinar si se forman inmunocomplejos.