MOLÉCULAS INHIBIDORAS DE LA ANGIOGÉNESIS Y SU USO EN EL TRATAMIENTO Y DIAGNÓSTICO DEL CÁNCER.

Una molécula que inhibe la angiogénesis, que se selecciona del grupo que consiste en el anticuerpo H33,

producido por el hibridoma 13H33 según está depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de entrada de depósito DSM ACC2622, y sus fragmentos y derivados que tienen la misma especificidad que H33 para su uso como un medicamento

La presente invención se refiere a moléculas que son capaces de inhibir la angiogénesis, a composiciones terapéuticas o diagnósticas que comprenden una o varias de las moléculas y al uso de tales moléculas en medicina, en particular en el tratamiento o el diagnóstico del cáncer, en particular de tumores sólidos. Además se describe un método para proporcionar tales moléculas. 5

La angiogénesis, o la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura preexistente, es fundamental para curar las heridas, para la reproducción y el desarrollo embrionario. La angiogénesis también es esencial en el desarrollo de tumores. Los nuevos vasos sanguíneos en los tumores proporcionan nutrientes que hacen que las células sufran una mitosis incontrolada.

Durante la angiogénesis, las células endoteliales proliferan, migran en el nuevo tejido y forman uniones interendoteliales 10 que conducen a la formación del tubo. Este proceso comienza y se realiza por factores angiogénicos. La señalización de VEGFs y angiopoyetinas conduce a la pérdida del contacto pericito-endotelial lo que permite la proliferación e interacción de nuevas células endoteliales con la matriz extracelular mediada por integrinas. Se ha descrito que las integrinas v3 y v5 participan en el desarrollo de los vasos sanguíneos y la angiogénesis vía una interferencia de señales con factores angiogénicos. 15

Además de las interacciones entre células endoteliales y la matriz extracelular, la regulación de contactos inter-endoteliales es importante para la formación del tubo. Por ejemplo, la molécula de adhesión VE-cadherina desempeña un papel en la remodelación vascular y mantiene la integridad de los vasos sanguíneos.

En la investigación que condujo a la presente invención fueron descubiertas las moléculas de adhesión intercelular JAM-B y JAM-C. Estas moléculas se encuentran en contactos célula-célula vasculares y están implicadas en la migración 20 transendotelial de leucocitos. Ahora se ha encontrado que la interacción entre JAM-B y JAM-C también desempeña un papel importante en la angiogénesis.

Según este descubrimiento, los inventores trataron de encontrar nuevas moléculas que fueran capaces de inhibir la angiogénesis.

Para esto, los inventores usaron un método que comprende las etapas de: 25

a) proporcionar una variedad de moléculas;

b) probar si estas moléculas pueden prevenir la interacción entre JAM-B y JAM-C;

c) analizar las moléculas positivas según su capacidad de bloquear la angiogénesis in vivo; y

d) seleccionar la moléculas que sean positivas en el ensayo in vivo según las moléculas inhiban la angiogénesis.

El análisis de las moléculas según su capacidad para bloquear la angiogénesis in vivo puede ser realizado por medio de 30 la prueba de retina que se describe en el Ejemplo 4.

Según la invención, fue encontrado que no todas las moléculas que pueden prevenir la interacción entre JAM-B y JAM-C son también capaces de inhibir la angiogénesis. El ensayo adicional de la etapa d) anterior es, por lo tanto, necesario para encontrar las moléculas deseadas.

Para encontrar las moléculas que son particularmente adecuadas según la invención, el método puede comprender 35 además la etapa de analizar las moléculas positivas según su capacidad de inhibir el crecimiento de tumores in vivo. El ensayo para inhibir el crecimiento de tumores in vivo es, por ejemplo, un ensayo como el que se describe en el Ejemplo 5.

Por medio de la etapa de aislar o producir las moléculas que inhiben la angiogénesis se produce la obtención real de las moléculas deseadas. 40

La variedad de moléculas que pueden ser analizadas en este método puede ser diversa. La variedad de moléculas puede ser apropiadamente, por ejemplo, una población de anticuerpos dirigidos contra JAM-B o JAM-C. La preparación de anticuerpos es una técnica directa que no requiere habilidad inventiva y, por ejemplo, se describe en Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975). El experto será, por lo tanto, capaz de proporcionar tal variedad sin un conocimiento extraordinario. 45

Los ensayos de moléculas que pueden prevenir la interacción entre JAM-B y JAM-C son realizados, por ejemplo, incubando células que expresan JAM-B o JAM-C en su superficie con JAM-C o JAM-B soluble marcado, respectivamente, en presencia de dichas moléculas y registrando una disminución en el marcaje de las células según se compara la incubación control sin dichas moléculas. Las moléculas que inducen una disminución en la cantidad de marcador visualizado en comparación con las células control que expresan JAM-C o JAM-B y que tienen JAM-B o JAM-50 C marcados, pero ninguna molécula que se analiza unidas a su superficie, se seleccionan como moléculas positivas.

Los marcadores adecuados son marcadores fluorescentes, radiactivos o basados en Biotina, que son conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para visualizar el marcador y la desaparición o su reducción son citometría de flujo, bioquímica o un ensayo inmunoenzimático (ELISA).

Las moléculas que se encuentran que inhiben la interacción entre JAM-B y JAM-C son analizadas además entonces según su capacidad de inhibir la angiogénesis in vivo. Para esto, están disponibles varias opciones. Sin embargo, la 5 prueba de la retina que se describe en el Ejemplo 4 es muy adecuada porque la remodelación de la vasculatura depende esencialmente de las células endoteliales y no de los factores microambientales. Otras pruebas son el ensayo de la membrana corioalantoidea, reperfusión isquémica o angiogénesis inducida por injerto de matrigel cargado con factores angiogénicos. Estas pruebas son conocidas en la técnica.

Además, o en vez de probar la capacidad de inhibir la angiogénesis in vivo, puede analizarse la capacidad de la 10 molécula de inhibir el crecimiento de tumores in vivo. Un ejemplo adecuado de tal ensayo es el que se describe en el Ejemplo 5.

El susodicho método finalmente condujo a la identificación del anticuerpo H33, producido por el hibridoma 13H33, depositado el 22 de octubre de 2003 con el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de entrada de depósito DSM ACC2622 como una molécula que inhibe la angiogénesis de la invención. Se 15 demostró que el anticuerpo H33, que es dirigido contra JAM-C, puede bloquear la angiogénesis in vitro e in vivo y prevenir el crecimiento de tumores in vivo. Esto reduce el reclutamiento de macrófagos en tumores. Esto también puede bloquear la interacción de JAM-C con JAM-B. El H33 no afecta a la proliferación, ni la apoptosis.

La invención se refiere por lo tanto al anticuerpo H33 para su uso como medicamento, en particular para el tratamiento del cáncer, más en particular para tratar tumores sólidos. Además, la invención se refiere a fragmentos y derivados de 20 H33, que tienen la misma especificidad que H33 para su uso como medicamento. Tales fragmentos y derivados son en particular fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos de unión de antígeno de dominio simple, anticuerpos recombinantes que tienen especificidad de H33, scFv y sus agregados, VHHS, los derivados humanizados del H33, anticuerpos quiméricos que comprenden al menos la especificidad de H33 o anticuerpos monoclónicos humanos que tienen la especificidad de H33. Éstos son producidos apropiadamente en ratones transgénicos u otros animales como 25 será explicado más adelante en este documento.

La invención además se refiere a fragmentos de anticuerpos y derivados de anticuerpos que retienen la capacidad de unión del antígeno al anticuerpo entero como tal. Tales fragmentos y derivados de H33 no se han descrito en la técnica anterior y son, por eso, nuevos.

Los fragmentos funcionales de anticuerpos que se unen al antígeno pueden modificarse por proteolisis de anticuerpos 30 (digestión de papaína, digestiones de pepsina u otros enfoques enzimáticos), produciendo Fab, Fv o dominios simples.

O bien, pueden producirse fragmentos recombinantemente. Los fragmentos de Fab ("unión de antígeno a fragmento") son los dominios de unión del antígeno de una molécula de anticuerpo, que contiene VH + CH1 y CL + VL. Entre CL y CH1 se presenta un enlace disulfuro intercadena. El peso molecular del heterodímero tiene, por lo general, aproximadamente 50 kDa. Los fragmentos... [Seguir leyendo]

1. Una molécula que inhibe la angiogénesis, que se selecciona del grupo que consiste en el anticuerpo H33, producido por el hibridoma 13H33 según está depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de entrada de depósito DSM ACC2622, y sus fragmentos y derivados que tienen la misma especificidad que H33 para su uso como un medicamento. 5

2. La molécula que inhibe la angiogénesis según se reivindica en la reivindicación 1, en la que la molécula se selecciona del grupo que consiste en:

a. un anticuerpo humanizado basado en H33 y que tiene la misma especificidad que el anticuerpo H33;

b. un anticuerpo quimérico basado en H33 y que tiene la misma especificidad que el anticuerpo H33;

c. un fragmento de H33 seleccionado de: 10

i. un fragmento Fab,

ii. un fragmento Fv;

iii. un fragmento de unión antígeno de dominio simple;

iv. un scFv, un dímero de un scFv, un trímero de scFv y un agregado más grande de un scFv;

v. VHH; 15

d. un anticuerpo recombinante que tiene especificidad de H33; y

e. un anticuerpo monoclónico humano que tiene especificidad como H33, para uso como un medicamento

3. La molécula que inhibe la angiogénesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la molécula:

a. bloquea la angiogénesis in vitro e in vivo;

b. previene el crecimiento de tumores in vivo; 20

c. reduce el reclutamiento de macrófagos en tumores; y

d. bloquea la interacción de JAM-C con la JAM-B, para su uso como un medicamento

4. La molécula que inhibe la angiogénesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en la terapia del cáncer.

5. La molécula que inhibe la angiogénesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el diagnóstico 25 in vivo del cáncer.

6. El uso de una molécula que inhibe la angiogénesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el diagnóstico in vitro del cáncer.

7. La molécula que inhibe la angiogénesis según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en la que el cáncer es un tumor sólido. 30

8. Una composición farmacéutica que comprende una molécula que inhibe la angiogénesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 junto con un excipiente adecuado, vehículo o diluyente, para su uso como un medicamento.

9. Una composición farmacéutica que comprende una molécula que inhibe la angiogénesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 junto con un excipiente adecuado, vehículo o diluyente, para su uso como un medicamento para el tratamiento del cáncer. 35