Mezclas de oligosacáridos derivados de heparina, su preparación y las composiciones farmacéuticas que las contienen.

Mezclas de oligosacáridos sulfatados que poseen la estructura general de los polisacáridos que constituyen la heparina y que presentan las características siguientes:

- tienen un peso molecular medio de 2000 a 3000 daltons.

tienen una actividad anti-Xa >150 UI/mg y< 200 UI/mg,

- tienen una actividad anti-IIa inferior a 10 UI/mg,

- tienen una relación actividad anti-Xa/actividad anti-IIa superior a 30,

- los oligosacáridos constitutivos de las mezclas :

- contienen de 2 a 26 restos sacarídicos.

tienen un resto ácido urónico-4, 5 insaturado 2-O-sulfato en uno de sus extremos,

- contienen una fracción hexasacárida que representa de 15 a 25 % de las mezclas de oligosacáridos,

- contienen de 8 a 15 % del hexasacárido LIIa-IIs-Is en la fracción hexasacárido y están en forma de una sal de metal alcalino o alcalinotérreo.

Mezclas de oligosacáridos derivados de heparina, su preparación y las composiciones farmacéuticas que las contienen La presente invención se refiere a mezclas de oligosacáridos derivados de heparina, a su procedimiento de preparación y a las composiciones farmacéuticas que las contienen.

La heparina es una mezcla de mucopolisacáridos sulfatados de origen animal, utilizada principalmente por sus propiedades anticoagulantes y antitrombóticas.

La heparina presenta sin embargo inconvenientes que limitan las condiciones de su utilización. En particular, su actividad anticoagulante (actividad anti-IIa) importante puede ocasionar hemorragias.

Se han propuesto las heparinas de bajo peso molecular obtenidas por despolimerización básica de ésteres de heparina (EP40144) ; sin embargo, estos productos presentan todavía una actividad anti-IIa importante.

Se han descrito igualmente heparinas de muy bajo peso molecular en el documento de patente US6384021. Sin embargo, los valores de actividad anti-Xa obtenidos en los ejemplos descritos no sobrepasan los 120 UI, y la relación anti-Xa/anti-IIa obtenida está comprendida entre 15 y 50.

En el documento WO-0208295, se preparan heparinas de muy bajo peso molecular por un procedimiento diferente del documento US6384021 y que presentan una actividad comprendida entre 100 y 150 UI con relaciones anti-Xa/anti-IIa igualmente muy elevadas para algunos ejemplos de aplicación.

La solicitud de Patente Europea EP-A-027089 divulga fracciones de oligosacáridos que poseen una actividad anti-Xa superior a la de la heparina no fraccionada.

Existe sin embargo una necesidad constante en de esta clase de medicamentos de mejorar las actividades anti-Xa, particularmente obteniendo actividades superiores a 150 UI/mg, así como la relación anti-Xa/anti-IIa, y por lo tanto de poner a punto nuevas generaciones de derivados de heparinas.

Uno de los objetivos de la invención es por lo tanto mejorar la actividad anti-Xa y la relación anti-Xa/anti-IIa modificando los procedimientos descritos en la técnica anterior, particularmente controlando el porcentaje de agua en la etapa de despolimerización. Las heparinas así obtenidas presentan de ese modo una excelente actividad antitrombótica y poseen una actividad aXa próxima a la de la heparina, disminuyendo los riesgos de hemorragia con una actividad aIIa muy débil. Igualmente, los productos de la invención presentas duraciones de semi-vida muy superiores a las de la heparina.

La invención tiene por objeto nuevas mezclas de oligosacáridos derivados de heparina que poseen una actividad más selectiva frente al factor X activado (factor Xa) y el factor II activado (factor IIa) que la heparina.

Se entiende que las mezclas de polisacáridos que tienen un peso molecular medio de 1500 a 3000 Da pueden calificarse de oligosacáridos.

La presente invención tiene por lo tanto por objeto las mezclas de oligosacáridos sulfatados que poseen la estructura general de los polisacáridos constitutivos de la heparina y que presentan las características siguientes:

. tienen un peso molecular medio de 2000 a 3000 dalton, una actividad anti-Xa > 150 UI/mg y < 200 UI/mg, una actividad anti-IIa inferior a 10 UI/mg y una relación actividad anti-Xa/actividad anti-IIa superior a 30, . los oligosacáridos constitutivos de las mezclas contienen de 2 a 26 restos sacarídicos, tienen un resto ácido urónico-4, 5 insaturado 2-O-sulfatado en uno de sus extremos, contienen una fracción hexasacárida que representa de 15 a 25 % de las mezclas de oligosacáridos, y contienen de 8 a 15 % del hexasacárido LIIa-IIs-Is en la fracción hexasacárida :

El hexasacárido LIIa-IIs-Is contenido en la mezcla de oligosacáridos descrita en la presente invención es una secuencia fuertemente afín a ATIII y se caracteriza por una actividad aXa superior a 740 UI/mg.

La mezcla de oligosacáridos descrita en la presente invención está en forma de una sal de metal alcalino o alcalinotérreo.

Como sal de metal alcalino o alcalinotérreo, se prefieren las sales de sodio, potasio, calcio y magnesio.

El peso molecular medio se determina por cromatografía líquida de alta presión utilizando dos columnas en serie por ejemplo las comercializadas con el nombre de TSK G3000 XL y TSK G2000 XL. La detección se realiza por refractometría. El eluyente utilizado es nitrato de litio y el caudal es 0, 6 ml/min. El sistema se calibra con estándares preparados por fraccionamiento de la enoxaparina (AVENTIS) por cromatografía en gel de agarosa-poliacrilamida (IBF) . Esta preparación se realiza según la técnica descrita por Barrowcliffe et al, Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78)

o D.A. Lane et al, Thromb. Res., 12, 257-271 (1977-78) . Los resultados se calculan mediante el programa informático GPC6 (Perkin Elmer) .

La actividad anti-Xa se mide por el método amidolítico sobre un sustrato cromogénico descrito por Teien et al., Thromb. Res., 10, 399-410 (1977) , con como patrón el primer patrón internacional de las heparinas de bajo peso molecular.

La actividad anti-IIa se mide por la técnica descrita por Anderson L.O. et al., Thromb. Res., 15, 531-541 (1979) , con como patrón el primer patrón internacional de las heparinas de bajo peso molecular.

La fracción hexasacárida representa de 15 a 25 % de la mezcla de oligosacáridos.

Las mezclas según la invención contienen de 8 a 15% del hexasacárido LIIa-IIs-Is en la fracción hexasacárida de la mezcla de oligosacáridos.

El porcentaje de la fracción hexasacárida puede determinarse de forma analítica por cromatografía líquida de alta presión en columnas TSK G3000 XL y TSK G2000 XL o bien por separación preparativa de la fracción hexasacárida. La mezcla en este caso se cromatografía sobre columnas rellenas de gel de tipo poliacrilamida agarosa tal como la comercializada con la marca Ultrogel ACA202R (Biosepra) . La mezcla se eluye con una disolución de hidrógenocarbonato de sodio. Preferentemente, la disolución de hidrógenocarbonato de sodio es una disolución de 0, 1 mol/l a 1 mol/l. Aún más preferentemente, la separación se realiza a una concentración de 1 mol/l. La detección se realiza por espectrometría UV (254nm) . Después del fraccionamiento, la fracción hexasacárida en disolución en hidrógenocarbonato de sodio se neutraliza con ácido acético glacial. La disolución se concentra bajo presión reducida de forma que se obtiene una concentración de acetato de sodio superior a 30% en peso. La fracción de hexasacárido se precipita por adición de 3 a 5 volúmenes de metanol. La fracción de hexasacáridos se recupera por filtración sobre vidrio sinterizado n°3. La mezcla de hexasacáridos obtenida puede analizarse por HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución) para determinar el contenido en hexasacárido LIIa-IIs-Is. El hexasacárido LIIa-IIs-Is puede aislarse por cromatografía HPLC preparativa o por cromatografía de afinidad en columna antitrombina III sefarosa según las técnicas utilizadas por el experto en la técnica (M. Hook, I. Bjork, J. Hopwood y U. Lindahl, F.E B.S letters, vol 656 (1) (1976) ) .

De preferencia, las mezclas según la invención tienen una actividad anti-IIa inferior a 5 UI/mg, y más particularmente de 0, 5 a 3, 5 UI/mg. Los ejemplos de aplicaciones descritos más abajo ponen en evidencia valores comprendidos entre 1, 1 y 1, 6 UI/mg cuando se realizan las características preferidas del procedimiento.

De preferencia, las mezclas presentan una relación actividad anti-Xa/actividad anti-IIa superior a 50 y más particularmente superior a 100.

De preferencia, las mezclas según la invención tienen un peso molecular medio comprendido entre 2400 y 2650 Da.

La invención tiene por lo tanto particularmente por objeto las mezclas tal como se definen anteriormente que presentan una actividad anti-Xa > 150 UI/mg y < 200 UI/mg, una actividad anti-IIa comprendida entre 0, 5 y 3, 5 UI/mg y un peso molecular medio comprendido entre 2400 y 2650 Da.

Las mezclas de oligosacáridos según la invención pueden prepararse por despolimerización de una sal de amonio cuaternario del éster bencílico de la heparina en medio orgánico, por medio de una base orgánica fuerte de pKa superior a 20 (propiedades de preferencia emparentadas con la familia de los fosfazenos definidas por ejemplo según R. Schwesinger et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.... [Seguir leyendo]

1. Mezclas de oligosacáridos sulfatados que poseen la estructura general de los polisacáridos que constituyen la heparina y que presentan las características siguientes:

- tienen un peso molecular medio de 2000 a 3000 daltons.

5. tienen una actividad anti-Xa > 150 UI/mg y < 200 UI/mg,

- tienen una actividad anti-IIa inferior a 10 UI/mg,

- tienen una relación actividad anti-Xa/actividad anti-IIa superior a 30,

- los oligosacáridos constitutivos de las mezclas :

- contienen de 2 a 26 restos sacarídicos.

10. tienen un resto ácido urónico-4, 5 insaturado 2-O-sulfato en uno de sus extremos,

- contienen una fracción hexasacárida que representa de 15 a 25 % de las mezclas de oligosacáridos,

- contienen de 8 a 15 % del hexasacárido LIIa-IIs-Is en la fracción hexasacárido

y están en forma de una sal de metal alcalino o alcalinotérreo.

2. Mezcla de oligosacáridos según la reivindicación 1, caracterizada por que la sal de metal alcalino o alcalinotérreo se elige entre las sales de sodio, potasio, calcio y magnesio.

3. Mezcla de oligosacáridos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada por que tiene actividad anti-IIa inferior a 5 UI/mg .

4. Mezcla de oligosacáridos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada por que presenta una 20 relación actividad anti-Xa/actividad anti-IIa superior a 50 .

5. Mezcla de oligosacáridos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 à 4 caracterizada por que tiene un peso molecular medio comprendido entre 2400 y 2650 Da.

6. Mezcla de oligosacáridos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 à 5 caracterizada por que presenta una

actividad anti-Xa > 150 UI/mg y < 200 UI/mg, una actividad anti-IIa comprendida entre 0, 5 y 3, 5 UI/mg, y un peso 25 moléculas medio comprendido entre 2400 y 2650 Da.

7. Procedimiento de preparación de las mezclas de oligosacáridos tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, durante el que se despolimeriza la sal de amonio cuaternario del éster bencílico de la heparina en medio orgánico en presencia de una base orgánica fuerte de pKa superior a 20, caracterizado pro que la base orgánica utilizada consiste en la familia de los fosfazenos que contiene un porcentaje de agua inferior a 0, 3%.

8. Procedimiento de preparación según la reivindicación 7 de mezclas de oligosacáridos según la reivindicación 1, caracterizado por que el contenido de agua es inferior al 0, 2 %.

9. Procedimiento de preparación según las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado por que la sal de amonio cuaternario del éster bencílico de la heparina es la sal de bencetonio, de cetilpiridinio o de cetiltrimetil amonio.

10. Procedimiento de preparación según las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado por que las bases de la familia de los fosfazenos son las de fórmula :

en la que los radicales R1 a R7 son idénticos o diferentes y representan radicales alquilo lineales o ramificados que 5 contienen de 1 a 6 átomos de carbono.

11. Procedimiento de preparación según la reivindicación 10, caracterizado por que la base de la familia de los fosfazenos utilizada en la etapa de despolimerización es la 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1, 3-dimetilperhidro-1, 2, 3diazafosforina o el terc-butilimino-tri (pirrolidino) -fosforano.

12. Procedimiento de preparación según las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado por que la relación en moles base 10 fuerte/éster está comprendido entre 0, 2 y 5.

13. Procedimiento de preparación según las reivindicaciones 7 u 8 en el que se efectúan las operaciones siguientes : a) Transalificación de la heparina de sodio por acción de cloruro de bencetonio, b) Esterificación del heparinato de bencetonio obtenido por acción de cloruro de bencilo, c) Transalificación del éster bencílico obtenido y obtención de la sal de amonio cuaternario, d) Despolimerización de la sal de amonio cuaternario del éster bencílico de la heparina por el método tal como se define en la reivindicación 7 u 8, e) Transformación de la sal de amonio cuaternario en sal de sodio, f) Opcionalmente saponificación de la heparina por acción de una base, g) Opcionalmente purificación 14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado por que la reacción de la etapa a) se realiza por acción del cloruro de bencetonio en exceso, sobre la heparina sódica, a una temperatura cercana a 15 a 25°C con una relación molar sal/heparina sódica comprendida entre 3 y 4.

15. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado por que la esterificación de la etapa b) se efectúa en el seno de un disolvente orgánico clorado a una temperatura comprendida entre 25 y 45°C, y el éster en forma de sal de sodio se recupera a continuación por precipitación por medio de acetato de sodio al 10 % en peso en un alcohol a razón de 1 a 1, 2 volúmenes de alcohol por volumen de medio de reacción.

16. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 15, caracterizado por que el nivel de esterificación de la sal de amonio cuaternario del éster bencílico de la heparina está comprendido entre 50 y 100 %.

17. Procedimiento según la reivindicación 13, 15 ó 16 caracterizado por que se utiliza de 0, 5 a 1, 5 partes en peso de

cloruro de bencilo por 1 parte en peso de sal de bencetonio de la heparina con un tiempo de reacción que estará comprendido entre 10 y 35 h.

18. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado por que la transalificación de la etapa c) se efectúa por medio de un cloruro de amonio cuaternario en medio acuoso, a una temperatura comprendida entre 10 y 25°C.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado por que la relación en moles de cloruro de amonio 35 cuaternario/sal de sodio del éster bencílico de la heparina está comprendida entre 2 y 3.

20. Procedimiento según la reivindicación 13 caracterizado por que la transformación en sal de sodio de la sal de amonio cuaternario del éster bencílico de la heparina despolimerizada (etapa e) se efectúa por tratamiento del medio de reacción con una disolución alcohólica de acetato de sodio, a una temperatura comprendida entre 15 y 25°C.

21. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado por que la saponificación (etapa f) se efectúa por medio 40 de un hidróxido de metal alcalino en medio acuoso, a una temperatura comprendida entre 0 y 20°C.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado por que se utiliza de 1 a 5 equivalentes molares de hidróxido de metal alcalino.

23. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado por que se purifica (etapa g) por medio de peróxido de hidrógeno, en medio acuoso, a una temperatura de 10 a 50°C .

24. Medicamento que contiene las mezclas de oligosacáridos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

25. Medicamento según la reivindicación 24, caracterizado por que presenta una actividad antitrombótica.

26. Medicamentos según las reivindicaciones 24 ó 25, para la prevención o el tratamiento de trombosis venosas y arteriales, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, angina inestable, infarto de miocardio, isquemia cardiaca, enfermedades oclusivas de las arterias periféricas y fibrilación auricular, proliferación de las células musculares lisas aterosclerosis y arteriosclerosis, cáncer por la modulación de la angiogénesis y los factores de crecimiento y de los trastornos diabéticos.

27. Composiciones farmacéuticas que contienen al menos un medicamento tal como se ha definido en la reivindicación 24 y uno o varios excipientes o vehículos o aditivos farmacéuticamente inertes.

28. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 27, caracterizadas por que consisten en disoluciones inyectables por vía subcutánea o intravenosa.

29. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 27, caracterizadas por que consisten en una formulación 15 por inhalación destinada a la vía pulmonar.

30. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 27, caracterizadas por que consisten en una formulación para una administración destinada a la vía oral.

31. Mezclas de oligosacáridos sulfatados según la reivindicación 1, susceptibles de ser obtenidas por el procedimiento tal como se define en la reivindicación 13.