Un método de filtración de una muestra líquida que contiene una o más células y de purificación de los ácidos nucleicos de la célula o células en la muestra que comprende el paso de la muestra a través de una superficie de al menos una membrana contenida dentro de un equipo de filtración de flujo cruzado,

que tiene una entrada y una salida de la muestra, y la ruta de la entrada a la salida está parcialmente ocluida por al menos una membrana para generar una presión transmembrana, rompiendo las membranas celular y nuclear de la célula o células para liberar los ácidos nucleicos de la célula o células sobre la membrana o membranas indicadas o en las mismas, recuperando y purificando los ácidos nucleicos.

La presente invención se refiere a la separación de ácidos nucleicos a partir de células enteras en una muestra. En particular, se refiere a la recuperación de ADN genómico a partir de células provenientes de una muestra de sangre de un paciente.

Las técnicas actuales de separación de los ácidos nucleicos en una muestra pueden ser lentas y costosas, con pasos individuales de lisis celular, lisis nuclear, precipitación de proteínas, rehidratación del ADN y digestión del ARN. Uno de los muchos equipos disponibles para la purificación del ADN genómico a partir de, por ejemplo, muestras de sangre entera es el equipo de purificación de ADN genómico Wizard (RTM) vendido por Promega. Un equipo con la cantidad suficiente para purificar 50 muestras de 3 ml puede ser muy caro y el protocolo lleva unos 45 minutos. Existen otras técnicas, pero normalmente llevan más tiempo y tienen que emplearse proteinasas o disolventes orgánicos, o bien emplear columnas o resinas para purificar fracciones de una muestra.

En WO 96/17673 se revela un equipo de microfiltración con el cual se pueden filtrar volúmenes pequeños, y que comprende una membrana de fibras huecas montada sobre un tapón sólido y capaz de comunicarse con los dos extremos del tapón.

En WO 95/02049 se revela un método de purificación usando células de un compuesto diana tal como un ácido nucleico, en donde el método comprende:

1) La lisis de una suspensión celular para formar un lisado celular que contiene el compuesto diana;

2) La aplicación del lisado celular a un filtro para eliminar las células no deseadas y los desechos celulares;

3) Poner en contacto el lisado filtrado con una matriz en fase sólida bajo condiciones tales que se enlace el ácido nucleico a la matriz;

4) La separación del lisado filtrado obtenido de la matriz; y

5) Elución del compuesto diana de la matriz.

A partir de un primer aspecto, la presente invención ofrece un método de filtración de una muestra líquida que contiene una o más células y la purificación de los ácidos nucleicos en la célula o células en la muestra que comprende el paso de la muestra a través de una superficie de al menos una membrana contenida dentro de un equipo de filtración de flujo cruzado que tiene una entrada de la muestra y una salida de la muestra, en donde la ruta de la entrada a la salida está ocluida parcialmente por al menos una membrana para generar una presión transmembrana, rompiendo las membranas celular y nuclear de la célula o células para liberar los ácidos nucleicos de la célula o células sobre la membrana o membranas indicadas o en las mismas, recuperando y purificando los ácidos nucleicos.

La presente invención supone una mejora con respecto al estado anterior de la técnica, ofreciendo un método novedoso para purificar los ácidos nucleicos a partir de células enteras en una muestra. Según la presente invención, se ofrece un método para la purificación de ácidos nucleicos a partir de células enteras en una muestra que comprende el paso de la muestra a través de la superficie de al menos una membrana porosa contenida en un equipo de filtración que posee una entrada y una salida de la muestra, y la ruta entre la entrada y la salida está ocluida parcialmente por la membrana o membranas, generando una presión transmembrana.

La técnica del flujo de filtración a través de la superficie de una membrana se conoce generalmente como “filtración de flujo cruzado” (véase por ejemplo, Hood, R., 1998, New Frontiers in Screening for Microbial Biocatalysts, 77-86; WO 96/04067; WO 96/04068; WO 96/17673; WO 96/20402). El presente inventor ha descubierto que, sorprendentemente, esto puede usarse para romper las membranas celulares y nucleares con el fin de purificar los ácidos nucleicos. Mediante la oclusión sólo parcial de la ruta entre la entrada y la salida, esto es, permitiendo el flujo alrededor de la membrana o membranas, es posible que pedazos más grandes de desechos celulares pasen alrededor de la membrana en lugar de tapar los poros. No sólo se rompen las células, sino que se depositan los ácidos nucleicos contenidos en las mismas sobre la superficie e interior de la membrana. Los experimentos (más adelante) han demostrado que la membrana retiene una proporción muy alta de ácidos nucleicos celulares. Más aún, en pruebas (véase más adelante) usando marcadores de peso molecular como estándares de comparación, se ha demostrado también que el peso molecular promedio del ADN recuperado es muy alto, lo que indica que aunque las fuerzas de corte ejercidas sobre las células son suficientes para romper las membranas celulares y nucleares, no son tan altas como para causar un corte extenso de los ácidos nucleicos.

Esto es especialmente importante durante las pruebas posteriores de los ácidos nucleicos recuperados, ya que las cadenas dañadas podrían no presentar un sitio de enlace apropiado (por ej., epítopo) o no presentar una secuencia suficiente para el enlace específico del cebador en RCP y la elongación con el fin de efectuar la amplificación.

Se requiere una presión transmembrana mínima de 0,25 bar para efectuar la ruptura celular. Al aumentar la presión transmembrana, la ruptura es más eficiente, se observa un aumento ligero en el corte de los ácidos nucleicos y, a presiones más altas, puede ocurrir la deformación de la membrana. Al aumentarse la presión transmembrana, también se observa que una mayor cantidad de ácidos nucleicos se depositan en los poros/intersticios de la membrana de filtración, y a presiones transmembrana altas es posible que los ácidos nucleicos, especialmente los tramos más cortos de los mismos, se forzasen completamente a través de la membrana y, por lo tanto, no fuesen retenidos sobre la misma. Debido a todo esto, parece que una presión transmembrana máxima de aproximadamente 1,25 bar es apropiada, aunque por supuesto la presión transmembrana máxima de un equipo particular podría determinarse fácilmente usando experimentos sencillos.

**(Ver fórmula)**

El examen de las membranas usando un microscopio óptico ha demostrado que su superficie está cubierta por ácidos nucleicos y no se observan otros componentes celulares.

La eliminación de otros componentes celulares puede mejorarse mediante el empleo de membranas que poseen un lumen (por ej., membranas de fibras huecas), ya que permiten la salida del filtrado a través del lumen. Por ejemplo, un extremo de una membrana de fibra hueca (o series de membranas de fibra hueca) puede sellarse y el otro extremo de la membrana o membranas conectarse a un estrangulador de lumen para permitir el escape del filtrado cuando la presión es lo suficientemente alta para abrir el estrangulador. Por ejemplo, podrá emplearse un equipo con un estrangulador de salida de 0,5 bar con una salida de lumen con un estrangulador de 0,25 bar. Alternativamente, la presión requerida para abrir el estrangulador de lumen podría ser mayor que la de la válvula de salida, en cuyo caso los ácidos nucleicos se depositarán predominantemente sobre la parte externa de la membrana en lugar de en los poros/intersticios. Una presión demasiado baja para abrir el estrangulador de lumen podría tener como resultado una presión transmembrana demasiado alta, lo que a su vez causaría un aumento en el corte de los ácidos nucleicos y la pérdida de los mismos a través de la salida de lumen. Una persona conocedora de las técnicas podría determinar fácilmente los valores apropiados para los estranguladores de salida y lumen usando experimentos sencillos.

En los experimentos (véase más adelante) también se ha demostrado que la amplificación RCP puede dar resultados al hacerse directamente sobre las membranas que contienen los ácidos nucleicos unidos; el ARN podría amplificarse usando un paso inicial de transcripción inversa. Las técnicas de RCP se conocen bien (PCR (Volumen 1): A practical approach. Eds. M.J. McPherson, P. Quirke y G.R. Taylor. Oxford University Press, 1991) y pueden usarse fácilmente.

La sencilla metodología de la presente invención implica que el equipo usado puede ser relativamente barato. Es importante que los ácidos nucleicos, especialmente el ADN genómico, pueden recuperarse a partir de una muestra, por ejemplo una muestra de sangre entera, en un tiempo muy corto; en los experimentos (véase más adelante) se demuestra que los ácidos nucleicos pueden separarse de 5 muestras de 1 ml en unos 2 minutos.

Naturalmente, es deseable recuperar la cantidad más alta... [Seguir leyendo]

1. Un método de filtración de una muestra líquida que contiene una o más células y de purificación de los ácidos nucleicos de la célula o células en la muestra que comprende el paso de la muestra a través de una superficie de al menos una membrana contenida dentro de un equipo de filtración de flujo cruzado, que tiene una entrada y una salida de la muestra, y la ruta de la entrada a la salida está parcialmente ocluida por al menos una membrana para generar una presión transmembrana, rompiendo las membranas celular y nuclear de la célula o células para liberar los ácidos nucleicos de la célula o células sobre la membrana o membranas indicadas o en las mismas, recuperando y purificando los ácidos nucleicos.

2. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque los ácidos nucleicos purificados se analizan para identificarlos.

3. El método de las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque se selecciona al menos una membrana entre las membranas de polietileno y polisulfona.

4. El método de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque al menos una membrana es hidrófila o contiene una carga positiva.

5. El método de las reivindicaciones 2 a 4 caracterizado porque el análisis del ácido nucleico se realiza mientras dicho ácido nucleico está retenido sobre la membrana o membranas y/o en las mismas.

6. El método de las reivindicaciones 2 a 5 caracterizado porque el análisis incluye un paso de amplificación llevado a cabo por amplificación RCP.

7. El método de la reivindicación 6 caracterizado porque el ácido nucleico que va a analizarse es ARN y se amplifica mediante transcripción inversa.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la membrana o membranas han sido pretratadas para poner ásperas las superficies de la membrana o membranas con el fin de romper la célula o células.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la membrana o membranas han sido pretratadas con agentes para detectar los ácidos nucleicos concretos o secuencias de ácidos nucleicos.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque el análisis se hace mediante un análisis de tipo ELISA.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque los ácidos nucleicos se eluyen de al menos una de las membranas.

12. El método de la reivindicación 11 caracterizado porque la elución se hace mediante el empleo de una corriente eléctrica.

13. El método de la reivindicación 12 caracterizado porque se aplica la corriente eléctrica a la solución que rodea al menos una de las membranas.

14. El método de las reivindicaciones 11 a 13 caracterizado porque se separan diferentes moléculas de ácidos nucleicos entre sí usando una corriente eléctrica apropiada.

15. El método de la reivindicación 14 caracterizado porque la corriente es CA y se varía su frecuencia.

16. El método de la reivindicación 15 caracterizado porque la corriente CA tiene una frecuencia entre 100 hercios y 10 megahercios.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el análisis se hace con un chip genético.

18. El método de la reivindicación 17 caracterizado porque el chip genético se encuentra en la superficie de al menos una de las membranas.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque al menos una de las membranas se hace girar durante la purificación.