METODO DE PRODUCCION DE FITOENO Y/O FITOFLUENO, O MEZCLAS DE CAROTENOIDES CON ALTO CONTENIDO EN LOS MISMOS.
Método de producción de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos.
La presente invención describe un método biotecnológico que permite obtener de forma simple, efectiva y a gran escala preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos, mediante la utilización de nuevas cepas mutadas de Paracoccus sp. (FA1 y FA3) superproductoras de fitoeno y/o fitoflueno
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200800817.
Solicitante: VITATENE, S.A..
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: LEÓN.
Inventor/es: ESTRELLA DE CASTRO, ANTONIO, COSTA PEREZ, JAVIER, LOPEZ ORTIZ,JUAN FRANCISCO, DE LA FUENTE MORENO,JUAN LUIS, RODRIGUEZ SAIZ,MARTA, BARREDO FUENTE,JOSE LUIS.
Fecha de Solicitud: 19 de Marzo de 2008.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 17 de Septiembre de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12P5/02 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 5/00 Preparación de hidrocarburos. › acíclicos.
Clasificación PCT:
- C12P5/02 C12P 5/00 […] › acíclicos.
Fragmento de la descripción:
Método de producción de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos.
Campo de la invención
La presente invención describe un método biotecnológico que permite obtener de forma simple, efectiva y a gran escala, preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos, mediante la utilización de cepas mutadas de Paracoccus sp. superproductoras de fitoeno y/o fitoflueno. Por lo tanto, la presente invención es susceptible de ser aplicada en diversos campos de las ciencias de la vida, como por ejemplo en el campo alimentario, el farmacéutico o el cosmético.
Estado de la técnica
Los carotenoides son pigmentos de naturaleza isoprenoide sintetizados por ciertas bacterias, hongos y organismos fotosintéticos. Pueden clasificarse en dos tipos:
Todos estos compuestos juegan un papel importante en la dieta humana como antioxidantes y como precursores de la vitamina A. Por lo tanto, debido a sus características, los carotenoides son eficaces contra el cáncer y otras enfermedades. Debido a sus efectos beneficiosos para la salud y a sus atractivos colores, los carotenoides poseen una gran importancia comercial como colorantes y aditivos alimentarios [Ninet L. y Renaut J. (1979) En: Peppler HJ., Perlman D. (eds). Microbial Technology, 2nd. Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-544].
Diversas investigaciones apoyan la teoría de que el daño oxidativo sobre el ADN, proteínas y lípidos está directamente relacionado con la esperanza de vida, y que los antioxidantes naturales tales como ascorbato, tocoferol y carotenoides son compuestos importantes en la prevención de estas oxidaciones [Stadtman ER (1992) Science 257: 1220-1222; Sohal et al. (1993) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 90: 7255-7256]. Particularmente, en el caso del fitoeno han sido descritos efectos beneficiosos para la salud al tratarse de un compuesto con actividad antitumoral [Mathews-Roth MM (1982) Oncology 39: 33-37].
La producción de carotenoides por biosíntesis microbiana es un ejemplo clásico de competencia entre los procesos químicos y los biológicos. Los procesos biotecnológicos muestran, entre otras, la ventaja de permitir obtener de forma simple los carotenoides de estructura más compleja, así como los isómeros conformacionales que sólo existen de forma natural.
A pesar de la diversidad estructural y funcional de los carotenoides y xantofilas, su ruta biosintética es similar en los diferentes organismos, siendo el fitoeno la molécula precursora en todos los casos [Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98: 1687-1692; Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519; Lee & Schmidt-Dannert (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 1-11; Sandmann G (2003) Chem. Biol. 10: 478-479; Umeno et al. (2005) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69: 51-78].
La biosíntesis (Esquema 1) se inicia con la isomerización de isopentenil pirofosfato (IPP, C5) a dimetilalil pirofosfato (DMAPP, C5), catalizada por la enzima IPP isomerasa. Seguidamente una molécula de DMAPP se condensa con una molécula de IPP para generar geranil pirofosfato (GPP, C10), el cual se condensa nuevamente con una molécula de IPP para generar farnesil pirofosfato (FPP, C15); ambas reacciones están catalizadas por la enzima FPP sintasa. Una nueva condensación de una molécula de FPP con una molécula de IPP da lugar a geranilgeranil pirofosfato (GGPP, C20); esta reacción está catalizada por la enzima GGPP sintasa (codificada por el gen crtE). La condensación de dos moléculas de GGPP catalizada por la enzima fitoeno sintasa (codificada por el gen crtB) genera fitoeno (C40), molécula precursora de la ruta biosintética de carotenoides. La enzima fitoeno desaturasa (codificada por el gen crtI) introduce cuatro dobles enlaces en la molécula de fitoeno para sintetizar consecutivamente fitoflueno, ?-caroteno, neurosporeno y licopeno (C40). Finalmente, la enzima licopeno ciclasa (codificada por el gen crtY) se encarga de convertir los extremos acíclicos de la molécula de licopeno en anillos ß para formar secuencialmente ?-caroteno y ß-caroteno (C40).
En el caso de Phycomyces blakesleeanus, el color amarillo de su micelio puede ser modificado mediante mutación dando lugar a cepas con micelio de color rojo, blanco o varias gradaciones de amarillo. Los mutantes rojos acumulan licopeno, mientras que los blancos carecen de producción de carotenoides o acumulan fitoeno [Metha B.J. y Cerdá-Olmedo E. (1995) Applied Microbiology and Biotechnology 42: 836-838].
La utilización de Paracoccus sp. para la producción de astaxantina, adonixantina, equinenona, 3-hidroxiequinenona, zeaxantina, ß-caroteno, licopeno, o ß-criptoxantina está recogida en las patentes EP 635576, EP 1138208, EP 1229126, EP 1676925, o US 5935808.
Descripción de la invención
La presente invención describe un método biotecnológico, en adelante método de la invención, que permite obtener de forma simple, efectiva y a gran escala preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos, mediante la utilización de nuevas cepas mutadas de Paracoccus sp. (FA1 y FA3) superproductoras de fitoeno y/o fitoflueno.
Así, el problema técnico resuelto por la presente invención es la obtención de forma simple, efectiva y a gran escala de preparaciones estabilizadas de fitoeno y fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en fitoeno y fitoflueno, las cuales puedan aplicarse directamente en los campos alimentario, farmacéutico y cosmético.
Tal y como se cita en el estado de la técnica, existen varios documentos de patente que describen el uso de Paracoccus sp. para la producción de diversos carotenoides distintos del fitoeno y del fitoflueno. Sin embargo, ninguno de ellos se refiere a la utilización de las cepas de Paracoccus sp. mutadas (FA1 y FA3) conseguidas en la presente invención para la producción de fitoeno o fitoflueno. A la luz de los documentos citados en el estado de la técnica, se considera que la presente invención presenta: (i) novedad, ya que ninguno de los documentos del estado de la técnica divulga el uso de las cepas de Paracoccus sp. mutadas (FA1 y FA3) para la producción simple, efectiva y a gran escala de preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno; y (ii) actividad inventiva, ya que un experto medio en la materia no podría combinar de forma obvia los documentos expuestos en el estado de la técnica y resolver el problema técnico arriba planteado.
Figura 1
Cromatogramas HPLC de los carotenoides acumulados por la cepa Paracoccus sp. FA1
A: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 9,46 correspondiente a fitoeno. Derecha: Espectro de absorción obtenido por diodoarray del pico con RT 9,46. El máximo de absorción obtenido (286 nm) es característico del fitoeno (ver Tabla 1).
B: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 8,23 correspondiente a fitoflueno. Derecha: Espectro de absorción obtenido por diodoarray del pico con RT 8,23. El máximo de absorción obtenido (348 nm) es característico del fitoflueno (ver Tabla 1).
Figura 2
Cromatogramas HPLC de los carotenoides acumulados por la cepa Paracoccus sp. FA3
A: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 9,52 correspondiente a fitoeno. Derecha: Espectro de absorción obtenido por diodoarray del pico con RT 9,52. El máximo de absorción obtenido (286 nm) es característico del fitoeno (ver Tabla 1).
B: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 8,29 correspondiente a fitoflueno. Derecha: Espectro...
Reivindicaciones:
1. Método de obtención, de forma efectiva y a gran escala, de preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o de mezclas de carotenoides que contengan alto porcentaje de fitoeno y/o fitoflueno, que comprende la fermentación de las cepas mutantes Paracoccus sp. FA1 y/o Paracoccus sp. FA3.
2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la fermentación de las cepas mutantes Paracoccus sp. FA1 y Paracoccus sp. FA3 se lleva a cabo en un fermentador utilizando un programa específico de adición de glucosa.
3. Método, según la reivindicación 2, caracterizado porque el programa específico de adición de glucosa comprende una adición de glucosa al 70% desde las 20 horas hasta las 90 horas para mantener de 10 a 30 g/l de glucosa en el caldo de fermentación.
4. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la fermentación de las cepas mutantes Paracoccus sp. FA1 y Paracoccus sp. FA3 se lleva a cabo en un fermentador utilizando un programa específico de adición de glicerol.
5. Método, según la reivindicación 4, caracterizado porque el programa específico de adición de glicerol comprende una adición de glicerol al 66% desde las 20 horas hasta las 90 horas para mantener de 10 a 30 g/l de glicerol en el caldo de fermentación.
6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la proporción de fitoeno en la preparación estabilizada obtenida es de al menos el 10% del total de carotenoides.
7. Método, según la reivindicación 6, caracterizado porque la proporción de fitoeno en la preparación estabilizada obtenida es de al menos el 90% del total de carotenoides.
8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el nivel de producción de fitoeno de la cepa Paracoccus sp. FA1 es de al menos 866 mg/L.
9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el nivel de producción de fitoflueno de la cepa Paracoccus sp. FA1 es de al menos 7 mg/L.
10. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el nivel de producción de fitoeno de la cepa Paracoccus sp. FA3 es de al menos 2.066 mg/L.
11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el nivel de producción de fitoflueno de la cepa Paracoccus sp. FA3 es de al menos 19 mg/L.
12. Cepa mutante de Paracoccus sp. FA1 caracterizada por ser productora de fitoeno y/o fitoflueno.
13. Cepa mutante de Paracoccus sp. FA3 caracterizada por ser productora de fitoeno y/o fitoflueno.
14. Uso de una cepa mutada de Paracoccus sp. para producir fitoeno y/o fitoflueno.
15. Uso, según la reivindicación 14, en que la cepa mutada de Paracoccus sp. utilizada para producir fitoeno y/o fitoflueno es FA1.
16. Uso, según la reivindicación 14, en que la cepa mutada de Paracoccus sp. utilizada para producir fitoeno y/o fitoflueno es FA3.
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