METODO PARA MEJORAR LA TOLERANCIA A LA SALINIDAD.

Método para mejorar la tolerancia a la salinidad.La presente invención se refiere a un método específico para mejorar la tolerancia a la salinidad de organismos vivos y eliminar el sodio (Na+) de aguas,

suelos, lodos y cualquier otro medio que contenga este elemento, basado en el empleo de la secuencia aislada de un ácido nucleico que codifica para la fitoquelatina sintasa de Nicotiana glauca

Método para mejorar la tolerancia a la salinidad.

Campo de la invención

El campo de la presente invención se encuentra dentro del área de la biología molecular, y en particular en la implicación de genes de plantas en los procesos de detoxificación de sodio, el uso de organismos transformados expresando de forma constitutiva o inducida estos genes, y métodos de biorremediación para la recuperación de medios. Así, la presente invención se refiere a la puesta a punto de una herramienta y un método específico para mejorar la tolerancia a la salinidad de organismos vivos y eliminar el sodio (Na⁺) de aguas, suelos, lodos y cualquier otro medio que contenga este elemento, basado en el empleo del gen de la fitoquelatina sintasa de Nicotiana glauca.

Antecedentes de la invención

La salinización del suelo es uno de los problemas más importantes que tiene la agricultura para su desarrollo. El cambio climático global produce un incremento en el estrés hídrico, factor cosustancial del estrés salino, ya que el déficit hídrico es también la causa del incremento de las concentraciones de sal en los suelos.

Es sabido que la concentración de sal en el interior de la célula de muchos organismos se mantiene alrededor de 50-150 mM, lo que beneficia a la estructura proteica, por ejemplo, debido a las fuerzas electrostáticas. Sin embargo, una concentración de 300-500 mM inhibe las reacciones metabólicas alterando el balance entre las fuerzas electrostáticas e hidrofóbicas (Serrano R (1996) Int Rev of Cyt 165:1-52.).

La respuesta de las células al cloruro sódico (NaCl) se articula por un grupo de diversos mecanismos:

El Na⁺ puede entrar en la célula a través de varios tipos de canales, "voltage-dependent cation channels" y "voltage-independent cation channels" (VIC). Los VIC son la principal ruta de entrada de Na⁺ a las células de las plantas (Xiong L. et al. (2002) in Salt Tolerance. The Arabidopsis Book (American Society of Plant Biologists, pp 1-22). Debido a la similitud entre Na⁺ y K⁺, los transportadores de K⁺ dependientes de voltaje pueden facilitar la entrada de Na⁺; Por ejemplo, AtHKT1 de Arabidopsis (transportador de sodio con homología de secuencia a los transportadores de potasio de la familia HKT), está implicado en la conducción de Na+ de tallos a raíces. Esta recirculación parece jugar un importante papel en la tolerancia de las plantas al estrés salino (Berthomieu P et al. (2003) EMBO journal 22:2004-2014).

La variación en el potencial de membrana (valores ≤ 130 mV) facilita la entrada de Na⁺. La hiperpolarización en la membrana plasmática de levadura es producida por la ausencia del gen PMP3 (SNA1). Los homólogos en A. thaliana son RCI2A y RCI2B (BLT101 en trigo). La sobreexpresión de RCI2A puede aliviar la supresión del crecimiento y los daños foto-oxidativos reduciendo la entrada de Na⁺ en las raíces (Mitsuya S. et al. (2006) Physiologia Plantarum 128:95-102).

El papel que el Ca²⁺ juega en el intrincado grupo de respuestas a NaCl ha sido clarificado recientemente en varios aspectos. La sobre-expresión de ACA4 (Ca²⁺ ATPasa vacuolar de Arabidopsis thaliana) en levadura aumenta la tolerancia a sal (Geisler M. et al. (2000) Plant Physiol 124:1814-1827).

El Na⁺ es evacuado fuera de la células por medio de antiportadores Na⁺/H⁺, localizados en la membrana plasmática. De acuerdo con esto, la sobre-expresión del gen SOS1 de A. thaliana, que codifica para el antiportador de Na⁺/H⁺ de membrana plasmática SOS1, mejora la tolerancia a salinidad (Shi H. et al. (2003) Nat biotechnol 21:81-85). Además de la extrusión de iones Na⁺, una de las causas más importantes de la tolerancia a salinidad es su compartimentalización en la vacuola. El gradiente de protones que facilita el antiporte se produce por H⁺-ATPasas y H⁺-pirofosfatasas (PPasas) vacuolares. Las plantas transgénicas que sobreexpresan AVP1, H⁺-PPasa vacuolar, muestran una tolerancia salina que está correlacionada con el aumento del contenido fónico dentro de las plantas (Yamaguchi T. et al. (2005) Trends Plant Sci 10:615-620). Asimismo, plantas que sobreexpresan AtNHX1 (antiportador vacuolar Na⁺/H⁺ de Arabidopsis thaliana) fueron capaces de crecer, florecer y producir semillas en presencia de 200 mM NaCl en plantas transgénicas de Brassica napus (Zhang H-X. Et al. (2001) Proc Nat/ Acad Sci USA 98:12832-12836) y tomate transgénico (Zhang H-X. et al. (2001) Nat biotechnol 19:765-768). La sobreexpresión de AgNHX1 (procedente de la planta halófita Atriplex gmelini), BnNHX1 (Brassica napus), HbNHX1 (Hordeum brevisubculatum) y GhNHX1 (Gossipyum hirsutum) también juegan el mismo papel (Yamaguchi T. et al. (2005) Trends Plant Sci 10:615-620). La expresión heteróloga de TsVP (H⁺-PPasa clonada de Thellungiella halophila) en la levadura mutante ena1 (bomba que elimina Na⁺ fuera de la célula) suprime la hipersensibilidad a Na⁺. La planta de Tabaco transgénica que sobre-expresa TsVP consigue un 60% más de peso seco que el tipo salvaje cuando se expone a 300 mM NaCl (Gao F. et al. (2006) J Exp Bot 57:3259-3270).

Los osmolitos también juegan un papel relevante en la tolerancia a salinidad. Protegen contra la pérdida de agua y cambios en la estructura de la membrana plasmática como consecuencia de eliminar los efectos tóxicos de los ROS ("Reactive Oxygen Species") generados por el estrés salino. Prolina, glicina, betaina, trehalosa, manitol y sorbitol, producidos de manera abundante y acumulados en células tratadas con sal, representan un componente importante en las respuestas a estrés salino (Sahia C. et al. (2006) Physiol Plant 127:1-9). La sobreexpresión de enzimas implicadas en la ruta de detoxificación de ROS (SOD, CAT, GST, APX, GPX) resulta en un incremento de la tolerancia a estrés salino (Xiong L, Zhu J-K (2002)). Semillas de tabaco transgénico que sobre-expresan un cDNA que codifica para un enzima con actividad glutatión S-transferasa (GST) y glutatión peroxidasa (GPX), crecen más rápido que las semillas control cuando son expuestas a bajas temperaturas y estrés salino (Roxas V-P, Smith R-K, Jr, Allen E-R, Allen R-D (1997) Nat biotechnol 15:988-991). Las enzimas glioxalasa I (gly I) y glioxalasa II (gly II) son necesarias para la detoxificación de metilglioxal y confieren tolerancia a salinidad en plantas transgénicas de tabaco (Singla-Pareek S-L, Reddy M-K, Sopory S-K (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:14672-14677).

Hay una clara conexión entre el estrés oxidativo y el osmótico a través de las llamadas "Mitogen-Activated Protein Kinase" (MAPK). El gen EhHOG, que codifica una MAPK que tiene un papel esencial en la ruta de osmoregulación de levadura y otros eucariotas, fue aislado de Eurotium herbariorum del mar muerto. Cuando EhHOG fue sobreexpresado en el mutante hog1 de S. cerevisiae, el crecimiento y la morfología aberrante de hog1 fueron restaurados en condiciones de alto estrés osmótico (Jin Y, Weining S, Nevo E (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:18992-18997).

Varios genes inducidos por estrés salino pertenecen a la familia LEA. Son conocidos diversos tipos de LEA de Arabidopsis; RD ("Responsive to Dehydration"), COR ("COld-Regulated"), LTI ("Low Temperature-Induced"), KIN ("cold induced"). Todos estos tipos son inducidos por estrés salino, hídrico, bajas temperaturas y ABA. El arroz transgénico que sobre-expresa SNAC1 ("STRESS-RESPONSIVE NAC 1") es más sensible a ABA y pierde agua más lentamente por el cierre de los estomas, SNAC1 puede mejorar la tolerancia a la sequía y a la salinidad en arroz. (Hu H. et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:12987-12992).

La sensibilidad de las plantas a la presencia de sodio no es, por tanto, una característica inherente a las mismas, ya que se conocen diversas adaptaciones, tanto en tierra como en mar, a altas concentraciones salinas, como es el caso de las plantas halófitas. Esto indica que la tolerancia puede ser resuelta...

1. Secuencia aislada de un ácido nucleico que codifica para la fitoquelatina sintasa de Nicotiana glauca caracterizada por la SEQ ID NO 1.

2. Vector que comprende la secuencia de la reivindicación 1.

3. Vector, según la reivindicación 2, donde dicho vector es un plásmido.

4. Organismo modificado genéticamente con la secuencia de la reivindicación 1.

5. Empleo de la secuencia de la reivindicación 1 para mejorar la tolerancia a salinidad y/o acumulación de sodio en organismos vivos.

6. Método para mejorar la tolerancia a la salinidad y/o acumulación de sodio en un organismo vivo que comprende las siguientes etapas:

a. transformación del organismo vivo con una secuencia con función fitoquelatina sintasa con al menos un 35% de similaridad con la SEQ ID NO 1; y

b. expresión de la secuencia controlada por secuencias regulatorias funcionales en el organismo vivo.

7. Método, según la reivindicación 6, donde el organismo vivo es una planta.

8. Método, según la reivindicación 7, donde la planta es Nicotiana glauca.

9. Método según la reivindicación 6 donde la transformación del organismo vivo se lleva a cabo con la SEQ ID NO 1.

10. Método, según la reivindicación 9, donde el organismo vivo es una levadura.

11. Método, según la reivindicación 10, donde la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

12. Empleo de la secuencia de la reivindicación 1 para reducir o eliminar sodio de un medio líquido, sólido o gaseoso.

13. Método según reivindicaciones anteriores, para reducir o eliminar sodio de un medio líquido, sólido o gaseoso basado en las siguientes etapas:

a. transformar organismos vivos con la SEQ ID NO 1 o una secuencia con función fitoquelatina sintasa con al menos un 35% de similaridad con la SEQ ID NO 1;

b. identificar los organismos transformados en a) mediante selección con antibiótico,

c. sembrar el medio salinizado con los organismos identificados en b),

d. cultivar los organismos durante un periodo adecuado, y

e. recolectar los organismos.