Mejora de ensayos de fijación mediante análisis multiepitópico y determinación combinada de antígeno y anticuerpo.

Método para determinar simultáneamente un antígeno y un anticuerpo dirigido específicamente contra este antígeno en una muestra,

el cual comprende las siguientes etapas:

(a) preparación de una fase sólida sobre la cual, en una primera área de ensayo, se inmoviliza un receptor capaz de fijar el antígeno buscado y en una segunda área de ensayo, apartada de la primera, se inmoviliza un receptor capaz de fijar el anticuerpo buscado,

(b) puesta en contacto de la muestra con la fase sólida y un receptor libre, específico del analito, que lleva un grupo generador de señal o que puede unirse a un grupo generador de señal, y

(c) detección de la presencia o/y cantidad del antígeno y del anticuerpo por determinación del grupo generador de señal en la fase sólida.

Mejora de ensayos de fijación mediante análisis multiepitópico y determinación combinada de antígeno y anticuerpo

Se revela un método para detectar uno o vahos analitos en una muestra, identificando el analito con diversos reactivos capaces de fijarse a los analitos. Además se revela una fase sólida para detectar un analito, constituida por un soporte no poroso y por áreas de ensayo separadas espacialmente, de tal modo que cada área de ensayo contiene reactivos diferentes. La presente invención se refiere a un método para la determinación simultánea de un antígeno y de un anticuerpo dirigido específicamente contra este antígeno, así como al uso de una fase sólida para la realización de este método.

Los métodos de detección inmunológica permiten determinar un gran número de analitos. Dichos métodos de detección inmunológica se basan en la capacidad de fijación específica de analitos mediante determinados analitos, como por ejemplo en las interacciones de tipo antígeno-anticuerpo. Básicamente las determinaciones inmunológicas se pueden realizar en una serie de formatos de ensayo, como por ejemplo los de ensayo tipo sandwich, indirecto,

valoración por retroceso o puente.

La identificación fiable de las enfermedades infecciosas, p.ej. de una infección por virus, como por ejemplo VIH, VHB o VHC, es de especial interés para poder diagnosticar cuanto antes las personas afectadas. Generalmente, las determinaciones inmunológicas de anticuerpos contra VIH, VHB o VHC se efectúan mediante el formato de ensayo indirecto o mediante el formato puente. En estos casos, para detectar los anticuerpos se emplean casi siempre mezclas de varias proteínas o péptidos que llevan epítopos procedentes de la región nuclear y la envoltura del virus. Esta mezcla se inmoviliza sobre un soporte, es decir, una fase sólida. Dado que la clasificación como VIH-positivo es de gran importancia para los individuos y que los resultados falsamente positivos pueden tener consecuencias fatales, actualmente es preciso revisar en un ensayo de confirmación todos los resultados positivos obtenidos con esta determinación inmunológica en ensayos rutinarios. Como ensayo de confirmación se suele usar un método Western blot, en el que los componentes proteicos de un lisado vírico están aplicados sobre un soporte poroso. No obstante, en el caso del HCV es muy difícil cultivar el virus. Por tanto, en tal caso, como ensayo de confirmación, no se lleva a cabo ningún Western blot con Usado vírico, sino un RIBA (ensayo inmunoblot recombinante) del tipo dotblot, que comprende proteínas o péptidos recombinantes como reactivos de ensayo.

Un gran inconveniente de los ensayos rutinarios realizados actualmente es que, según el analito, se usan mezclas de 5 hasta 10 o más antígenos para la detección. Aunque los ensayos rutinarios se mejoran continuamente, todavía no se ha podido renunciar del todo a los ensayos de confirmación. Por ejemplo, en el ensayo Enzymun® HIV (de Boehringer Mannheim) se usa una mezcla de unos 5 antígenos diferentes, que para la detección están biotinilados o marcados con digoxigenina. Aunque el ensayo funciona bien, implica el uso de mezclas con un número tan grande de antígenos diferentes, que la inmovilización o fijación de cada uno de ellos sobre la fase sólida impide alcanzar una concentración óptima para la detección. Con una mezcla de tantos componentes, la fase sólida no tiene bastante capacidad para fijar todos los antígenos en una concentración óptima. Además, el uso de una mezcla de antígenos para recubrir una superficie de ensayo tiene como consecuencia que los diferentes antígenos compiten por los sitios de fijación sobre la fase sólida y los distintos tamaños pueden producir distintas velocidades de difusión y diversos efectos estéricos. En el caso de una aplicación directa, se fijan p.ej. antígenos hidrófobos de manera preferente a la superficie de plástico, mientras que simultáneamente se expulsan antígenos más hidrófilos. En consecuencia, por un lado solo se obtienen resultados difícilmente reproducibles, y por otro, la concentración de ciertos epítopos de antígenos resulta tan pequeña, que no permite ninguna detección significativa.

Otra desventaja del uso de mezclas de antígenos en los ensayos rutinarios es que con la mezcla de diferentes antígenos aumenta claramente el riesgo de una mayor fijación inespecífica, lo cual aumenta a su vez los resultados falsamente positivos. Como consecuencia, el límite de exclusión en los ensayos rutinarios efectuados hasta ahora debe establecerse bastante alto y por tanto se pierde sensibilidad. Sobre todo en el método Western blot, el número de resultados falsamente positivos por fijación inespecífica aumenta debido a las proteínas extrañas presentes en el lisado vírico, de tal manera que para un resultado positivo se requieren al menos 2 bandas reactivas.

Se ha intentado mejorar aún más la sensibilidad de este método de detección. La patente EP 0 461 462 A1 describe un inmunoensayo para detectar anticuerpos víricos con la ayuda de un ensayo de tipo indirecto. En el inmunoensayo del tipo dotblot descrito en la patente EP 0 461 462 A1, en lugar de un Usado vírico usual se aplican, individualmente, proteínas recombinantes purificadas en áreas de ensayo discretas sobre un substrato poroso, obteniéndose un formato de ensayo que, gracias al uso de proteínas purificadas, es más sensible que un Western blot.

La patente EP 0 627 625 A1 se refiere a un método para detectar anticuerpos víricos en una muestra mediante el formato puente. En este caso también se trata de un RIBA (ensayo inmunoblot recombinante), en que se aplican varios antígenos de manera espacialmente separada sobre una fase sólida de un material poroso, haciendo hincapié en la necesidad de emplear una fase sólida de material poroso.

La patente EP 0 445 423 A2 se refiere a un método para detectar anticuerpos de HCV con la ayuda de varios epítopos de un antígeno HCV. En la patente EP 0 445 423 A2 también se describe un inmunoensayo para la

determinación de anticuerpos, en el cual se alcanza una mayor sensibilidad mediante el uso de ciertos antfgenos mejorados.

Sin embargo, mediante este método descrito en el estado técnico, resulta difícil depositar una cantidad prefijada de reactivo sobre un soporte poroso de modo definido. Sobre todo cabe el riesgo de que los puntos Individuales de ensayo depositados se entremezclen. Estos inconvenientes son más graves cuanto menores son los puntos aplicados, y por lo tanto este método no sirve para los sistemas de ensayo miniaturizados. Además, el manejo de tiras de papel es difícil de automatizar y por tanto es impensable como ensayo rutinario.

Por consiguiente uno de los objetivos consistía en proporcionar un método que permitiera eliminar, al menos en parte, las desventajas del estado técnico.

Dicho objetivo se resuelve mediante un método para detectar un analito en una muestra, el cual comprende las

siguientes etapas:

(a) preparación de una fase sólida que comprende un soporte no poroso y, como mínimo, dos áreas de ensayo separadas espacialmente, cada una de la cuales contiene distintos receptores inmovilizados, específicos del

analito,

(b) puesta en contacto de la muestra con la fase sólida y al menos un receptor libre, específico del analito, que lleva un grupo generador de señal o capaz de unirse con un grupo generador de señal, y

(c) detección de la presencia o/y de la cantidad de analito mediante la determinación del grupo generador de señal sobre las áreas de ensayo.

El receptor inmovilizado, específico del analito, puede estar fijado tanto directa como indirectamente a la fase sólida mediante uno o más receptores. La fijación puede tener lugar por ejemplo mediante interacciones de tipo adsorbente o covalente, pero preferiblemente por interacciones de gran afinidad específica, p.ej. de tipo estreptavidina o avidina/ biotina o anticuerpo/antígeno.

El propio receptor libre, específico del analito, puede llevar un grupo generador de señal o ser capaz de unirse a un grupo generador de señal. En este caso, el reactivo detector consta de varios componentes.

En el caso de los analtos se puede tratar de una población homogénea o heterogénea, p.ej. una población heterogénea de anticuerpos, una mezcla de antfgenos o una mezcla de antfgenos y anticuerpos eventualmente diferentes, en la cual los antfgenos y anticuerpos proceden de unos o varios virus o son inducidos por ellos. En caso de poblaciones heterogéneas de analtos, cada una de las áreas de ensayo fija una población parcial del analto investigado. Los receptores específicos del analto, respectivamente inmovilizados sobre una... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar simultáneamente un antígeno y un anticuerpo dirigido específicamente contra este antígeno en una muestra, el cual comprende las siguientes etapas:

(a) preparación de una fase sólida sobre la cual, en una primera área de ensayo, se inmoviliza un receptor capaz de fijar el antígeno buscado y en una segunda área de ensayo, apartada de la primera, se inmoviliza un receptor capaz de fijar el anticuerpo buscado,

(b) puesta en contacto de la muestra con la fase sólida y un receptor libre, específico del analito, que lleva un grupo generador de señal o que puede unirse a un grupo generador de señal, y

(c) detección de la presencia o/y cantidad del antígeno y del anticuerpo por determinación del grupo generador de señal en la fase sólida.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno se detecta por medio de un ensayo sándwich.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo se detecta mediante un modelo de valoración por retroceso.

4. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo se detecta mediante un modelo tipo puente.

5. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo se detecta mediante un formato de ensayo indirecto.

6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el recubrimiento fijador de la primera área de ensayo está formado por anticuerpos inmovilizados específicos de un epítopo del antígeno buscado.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque los anticuerpos que son específicos de los diversos subtipos del antígeno buscado se aplican en áreas de ensayo separadas.

8. Método según la reivindicación 6 o 7, caracterizado porque el anticuerpo se elige entre los de tipo vírico, en particular los anticuerpos anti-VIH-l, anti-VIH-ll, anti-VHB y anti-VHC.

9. Método según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el recubrimiento fijador de la segunda área de ensayo está formado por antígenos que son específicos del anticuerpo buscado.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque los antígenos se eligen del grupo formado por VIH-I, VIH-II, VHByVHC.

11. Método según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el antígeno buscado es VIH p24 y el anticuerpo buscado es anti-p24.

12. Método según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se usa una fase sólida no porosa.

13. Método según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la detección se lleva a cabo con anticuerpos marcados dirigidos contra los analitos.

14. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque el marcador se elige entre grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes, marcadores radiactivos, marcadores enzimáticos, marcadores colorantes y partículas de sol.

15. Método según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la detección se lleva a cabo con un reactivo universal, en particular con partículas de látex marcadas.

16. Método según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la fase sólida se prepara aplicando directamente los recubrimientos fijadores específicos a cada área de ensayo por separado.

17. Método según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el recubrimiento de las áreas de ensayo está formado respectivamente por un solo tipo de molécula fijadora.

18. Uso de una fase sólida según un método de las reivindicaciones 1 a 17 para la determinación simultánea en una muestra de un antígeno y un anticuerpo dirigido específicamente contra este antígeno, que comprende al menos una primera área de ensayo y una segunda área de ensayo, caracterizado porque la primera área de ensayo presenta un recubrimiento de fijación específica con un antígeno y la segunda área de ensayo un recubrimiento de fijación específica con un anticuerpo dirigido contra este antígeno.

19. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque los recubrimientos son homogéneos y solo contienen respectivamente un único tipo de reactivo fijador.

20. Uso según la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque las áreas de ensayo están aplicadas sobre un

soporte no poroso.

21. Uso según la reivindicación 20, caracterizado porque el soporte no poroso es de poliestireno.

22. Uso según una de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque cada área de ensayo tiene un diámetro

de 0,01 hasta 1 mm.

23. Uso de un kit de ensayo para la determinación simultánea de un antígeno y de un anticuerpo dirigido específicamente contra este antigeno, incluyendo el empleo de una fase sólida según una de las reivindicaciones 18

a 22, así como reactivos de detección marcados.

24. Uso según la reivindicación 23, caracterizado porque el kit de ensayo incluye un reactivo de detección universal.