Medios diseñados racionalmente para un cultivo celular.

Un medio de cultivo celular que comprende entre 7 mM a 30 mM de leucina,

entre 7 mM a 30 mM de lisina, entre 7 mM a 30 mM de treonina, entre 7 mM a 30 mM de prolina y entre 7 mM a 30 mM de valina.

Medios diseñados racionalmente para un cultivo celular

Campo de la invención La divulgación se refiere a procedimientos para diseñar racionalmente medios de cultivo celular para su uso en cultivos celulares empleados, por ejemplo, en la producción de polipéptidos; medios de cultivo celular diseñados con los procedimientos desvelados; a procedimientos para producir grandes cantidades de un polipéptido de interés, por ejemplo, un anticuerpo, usando dichos medios; a polipéptidos producidos usando los procedimientos y los medios desvelados en el presente documento; y a composiciones farmacéuticas que contienen dichos polipéptidos. La invención es particularmente útil en cultivos celulares a gran escala. Los procedimientos y las composiciones que se desvelan en el presente documento son particularmente útiles para producir cantidades significativas de polipéptidos en cultivos discontinuos, semicontinuos y en perfusión, de células animales.

Técnica anterior relacionada Una gran proporción de productos biotecnológicos, ya sea disponibles en el comercio o únicamente en desarrollo, son agentes terapéuticos proteicos; por tanto, existe la demanda de producción de estos polipéptidos en cultivos celulares. Además, con frecuencia se requiere la maquinaria celular de una célula animal (a diferencia de, por ejemplo, una célula bacteriana) para producir muchas formas de agentes terapéuticos polipeptídicos (tales como proteínas glucosiladas o anticuerpos monoclonales (Acm) ) producidos por hibridomas. Por consiguiente, existe una creciente demanda para optimizar la producción de estos polipéptidos en cultivos celulares y particularmente en cultivos de células animales.

En comparación con los cultivos de células bacterianas, los cultivos de células animales tienen tasas de producción más bajas y típicamente generan rendimientos de producción más bajos. Por tanto, una cantidad significativa de investigación se centra en las condiciones de cultivo de células animales que optimicen la producción del polipéptido, es decir, condiciones que soporten una densidad celular elevada y un título elevado. Por ejemplo, se ha determinado que manteniendo las concentraciones de glucosa en medios de cultivo celular a bajas concentraciones y cultivando las células en una fase de producción a una osmolaridad de aproximadamente 400 a 600 mOSm se aumentaba la producción de proteínas recombinantes en cultivos de células animales, en los que, en todas las fases, el cultivo es también a una concentración de glutamina seleccionada (preferentemente entre aproximadamente 0, 2 a aproximadamente 2 mM) . También se ha determinado que el suministro limitado de glucosa a cultivos de células animales en procesos semicontinuos controla la producción de lactato sin requerir el suministro de glucosa a una tasa constante. Además, se sabe que la modificación de la concentración acumulativa total de aminoácidos, la concentración de aminoácidos individuales y las proporciones de aminoácidos individuales entre sí (por ejemplo, glutamina con respecto a asparagina) y de aminoácidos totales (por ejemplo, glutamina con respecto a aminoácidos totales) en los medios de un cultivo celular a gran escala puede dar como resultado una producción de polipéptidos a gran escala sustancialmente mejorada.

Tradicionalmente, los estudios del medio de los cultivos de células animales se centran en tres técnicas: 1) enriquecimiento de los componentes del medio del medio de partida y aumento de la frecuencia del suministro del cultivo; 2) aplicación de diseño multifactorial a diferentes fuerzas de medio y diferentes concentraciones de componentes; y 3) análisis del medio acondicionado (consumo) de aminoácidos, vitaminas y otros componentes, y adición de aquellos componentes que estén a bajos niveles o que se hayan agotado. Estos procedimientos generalmente usan respuestas de densidad celular, viabilidad y título como indicadores de optimización.

Sin embargo, los procedimientos anteriores únicamente detectan indirectamente las necesidades de nutrientes de las células en función del resultado final, es decir, densidad, viabilidad y título celular, en lugar de detectar y proporcionar a la célula las necesidades reales de nutrientes para optimizar la producción de proteínas.

Sumario de la invención La presente divulgación proporciona procedimientos para diseñar racionalmente medios de cultivo celular, por ejemplo, medios de cultivo celular a gran escala, para su uso, por ejemplo, en cultivos celulares a gran escala empleados en la producción de polipéptidos; medios de cultivo celular, por ejemplo, medios de cultivo celular a gran escala, diseñados con los procedimientos desvelados; procedimientos para producir grandes cantidades de un polipéptido de interés, por ejemplo, un anticuerpo, usando dichos medios; polipéptidos producidos usando los procedimientos y medios desvelados en el presente documento; y composiciones farmacéuticas que contengan dichos polipéptidos. Estos procedimientos y composiciones son útiles para cultivar, por ejemplo, cultivos celulares discontinuos, semicontinuos y en perfusión. Estos procedimientos y composiciones son particularmente útiles para el cultivo a gran escala, por ejemplo, cultivos discontinuos, semicontinuos y en perfusión, de células animales, por ejemplo, células de mamífero. La invención proporciona un medio de cultivo celular que comprende entre aproximadamente de 7 mM a 30 mM de leucina, entre aproximadamente de 7 mM a 30 mM de lisina, entre 7 mM a 30 mM de treonina, entre 7 mM a 30 mM de prolina y entre 7 mM a 30 mM de valina. La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para producir un polipéptido en un cultivo celular que comprende:

(1) proporcionar un cultivo celular, que comprende:

a. células, que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés; y

b. un medio de cultivo celular que comprende entre 7 mM a 30 mM de leucina, entre aproximadamente 7 mM a aproximadamente 30 mM de lisina, entre 7 mM a 30 mM de treonina, entre 7 mM a 30 mM prolina y entre 7 mM a 30 mM de valina; y

(2) mantener el cultivo celular en condiciones que permitan la expresión del polipéptido de interés.

Un medio diseñado racionalmente de la presente divulgación contiene una concentración de un aminoácido que se calcula para su uso en masa celular, una concentración del aminoácido que se calcula para su uso en el mantenimiento celular y una concentración del aminoácido que se calcula para su incorporación en el polipéptido de interés.

En una realización, la divulgación proporciona un procedimiento para producir un polipéptido en un cultivo celular que comprende proporcionar un cultivo celular, que comprende células, que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés, y un medio de cultivo celular deseado, que comprende una concentración de un aminoácido que se calcula para su uso en masa celular, una concentración del aminoácido que se calcula para su uso en el mantenimiento celular, y una concentración del aminoácido que se calcula para su incorporación en el polipéptido de interés; y, el mantenimiento del cultivo celular en condiciones que permitan la expresión del polipéptido de interés. En una realización de la divulgación, el medio de cultivo celular deseado comprende una concentración de aminoácidos inicial ajustada, A, de acuerdo con la fórmula A=[ (M*X) + (N*P) + (Y*M*X) ]*F, en la que X es una concentración del aminoácido que se usa por unidad de masa celular, P es una concentración del aminoácido que se usa para su incorporación en el polipéptido de interés por unidad de título de polipéptido, M es un multiplicador para una densidad celular pico deseada del cultivo celular, N es un multiplicador para una concentración deseada del polipéptido de interés, Y es un factor de mantenimiento celular y F es un factor inicial.

En otra realización, la divulgación proporciona un procedimiento para producir un polipéptido en un cultivo celular, que comprende proporcionar un cultivo celular, que comprende células, que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés; y un medio de cultivo celular de partida, en el que el volumen del medio de cultivo celular de partida es aproximadamente 60-99 % del volumen de un volumen de medio de cultivo celular deseado; proporcionar al cultivo celular un suministro del medio de cultivo celular, en el que el volumen del suministro del medio de cultivo celular es aproximadamente 1-40 % del volumen del medio de cultivo celular deseado, y en el que el medio de cultivo celular deseado resultante comprende una concentración de un aminoácido que se calcula para su uso en masa celular, una concentración del aminoácido... [Seguir leyendo]

1. Un medio de cultivo celular que comprende entre 7 mM a 30 mM de leucina, entre 7 mM a 30 mM de lisina, entre 7 mM a 30 mM de treonina, entre 7 mM a 30 mM de prolina y entre 7 mM a 30 mM de valina.

2. Un medio de cultivo celular de acuerdo con la reivindicación 1, que adicionalmente comprende 3 mM o más de tirosina.

3. Un medio de cultivo celular de acuerdo con 1 o 2, en el que la concentración combinada de leucina, lisina, treonina, prolina y valina está comprendida entre 60 % a 80 % de la concentración de aminoácidos esenciales totales en el medio de cultivo celular.

4. Un medio de cultivo celular de acuerdo con 1 o 2, en el que la concentración combinada de los aminoácidos esenciales está comprendida entre 30 % a 50 % de la concentración de los aminoácidos totales.

5. Un medio de cultivo celular de acuerdo con cualquiera de 1 a 4, que comprende una concentración total de aminoácidos de entre 120 mM y 350 mM.

6. Un medio de cultivo celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una concentración total de aminoácidos superior a 140 mM.

7. Un procedimiento para producir un polipéptido en un cultivo celular que comprende:

(1) proporcionar un cultivo celular, que comprende:

a. células, que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés; y

b. un medio de cultivo celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

(2) mantener el cultivo celular en condiciones que permitan la expresión del polipéptido de interés.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, que adicionalmente comprende un procedimiento de recuperación de un polipéptido purificado de un fluido de carga, que comprende las etapas de:

hacer pasar el fluido de carga a través de un medio en una columna en condiciones operativas que hacen que el medio se una a al menos 2, 8 mg de polipéptido por ml de medio, en el que el medio es seleccionado del grupo que consiste en un medio de intercambio iónico cargado, una resina de cromatografía de interacción hidrófoba, y una resina de cromatografía de afinidad metálica inmovilizada; y recuperar el polipéptido purificado del efluente de la columna.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, que adicionalmente comprende un procedimiento de recuperación de un polipéptido purificado de un fluido de carga, que comprende las etapas de:

hacer pasar el fluido de carga a través de un medio en una columna en condiciones operativas definidas por un coeficiente de partición de al menos 0, 1; y recuperar el polipéptido purificado del efluente de la columna.

10. Un procedimiento para producir un polipéptido en un cultivo celular que comprende:

(1) proporcionar un cultivo celular, que comprende:

a. células, que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés; y

b. un medio de cultivo celular de partida, en el que el volumen del medio de cultivo celular de partida es de 6090 % del volumen de un volumen del medio de cultivo celular deseado;

(2) proporcionar, al cultivo celular, un medio de cultivo celular de suministro de acuerdo con la etapa (1) , en el que el volumen del medio de cultivo celular de suministro es de 1-40 % del volumen del medio de cultivo celular deseado, y en el que el medio de cultivo celular deseado resultante es un medio de cultivo celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

(3) mantener el cultivo celular en condiciones que permitan la expresión del polipéptido de interés.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el cultivo celular es un cultivo celular a gran escala.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que las células son células animales.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 10 a 12, en el que el polipéptido está purificado.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en el que el medio es un medio definido.