Procedimiento para la identificación de moduladores de catecol O-metiltransferasa.

Un procedimiento para la identificación de un modulador de la actividad de la enzima catecol Ometiltransferasa (COMT) que comprende las etapas de:



a) proporcionar 4-nitrocatecol ligado covalentemente con Alexa Fluor 488 que tiene la fórmula I,

b) poner en contacto la molécula de la etapa a) con una enzima catecol O-metiltransferasa (COMT), Sadenosilmetionina (SAM) y un compuesto candidato y

c) medir la lectura de fluorescencia de la mezcla de la etapa b), en el que una lectura de fluorescencia alterada en presencia del compuesto candidato en comparación con un blanco es indicativa de un modulador de enzima catecol O-metiltransferasa (COMT).**Fórmula**

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/062704.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Inventor/es: ENDERLE,THILO, ROTH,DORIS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/48 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una transferasa.
  • G01N33/542 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › con inhibición estérica o modificación de la señal, p. ej. extinción de fluorescencia.
  • G01N33/573 G01N 33/00 […] › para enzimas o isoenzimas.
  • G01N33/58 G01N 33/00 […] › en los que intervienen sustancias marcadas (G01N 33/53 tiene prioridad).

PDF original: ES-2548902_T3.pdf

 

Ilustración 1 de Procedimiento para la identificación de moduladores de catecol O-metiltransferasa.
Ilustración 2 de Procedimiento para la identificación de moduladores de catecol O-metiltransferasa.
Ilustración 3 de Procedimiento para la identificación de moduladores de catecol O-metiltransferasa.
Ilustración 4 de Procedimiento para la identificación de moduladores de catecol O-metiltransferasa.
Ilustración 5 de Procedimiento para la identificación de moduladores de catecol O-metiltransferasa.
Procedimiento para la identificación de moduladores de catecol O-metiltransferasa.

Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la identificación de moduladores de catecol O-metiltransferasa

La presente invención se refiere a un procedimiento para la identificación de moduladores de la actividad de la enzima catecol O-metiltransferasa.

La catecol O-metiltransferasa (COMT) cataliza la O-metilación de sustratos que tienen un resto catecol. El donante de metilo en la metllaclón por COMT es la S-adenosilmetionina (SAM). La COMT desempeña un papel importante para el catabolismo de neurotransmlsores de catecolamina endógenos, catecolestrógenos y moléculas xenobióticas. La inhibición de COMT es un enfoque Importante para desarrollar nuevos tratamientos terapéuticos en la enfermedad de Parklnson.

W.F. Herblin ÍAnalvtical Biochemistrv 51, 19-22, 1973) describe un ensayo colorimétrico para la actividad de COMT. El ensayo usa nitrocatecol como aceptar de metilo para COMT. El nltrocatecol existe en forma de una solución amarilla en agua a pH ácido con un máximo de absorción a 350 nm. A pH ligeramente alcalino, la ionización del para-hldroxllo vuelve naranja la solución (Amáx = 430 nm). En base más fuerte, la ionización del meta-hidroxilo conduce a una solución de color rojo cereza (Amáx = 520 nm). El ensayo está basado en las observaciones de que el nitrocatecol se metila por COMT y que el nitrocatecol metllado no exhibe ya el color rojo cereza resultante de la segunda Ionización. En este ensayo, el sustrato (nltrocatecol) y SAM tienen que estar en un intervalo de concentración pM que está en o por encima de la Km, lo que limita la sensibilidad.

G. Zürcher y M. Da Prada (Journal of Neurochemistrv, vol. 38, n° 1, 1982) describen un ensayo radioquímico de una etapa para la actividad de COMT. En este ensayo, el catecol se convierte en guayacol tritiado, un compuesto de muy baja polaridad, al incubar COMT con [3H]metil-SAM, Mg2+ y adenoslna desaminasa. El guayacol se extrae usando un medio de baja polaridad, p.ej. tolueno, y contando en un contador de centelleo.

Los ensayos anteriormente descritos no son adecuados para cribar en un gran número de compuestos su actividad moduladora de COMT debido a la sensibilidad limitada (ensayo colorimétrico) o debido a la configuración del ensayo (etapa de extracción en el ensayo radioquímico).

Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento de ensayo homogéneo sensible adecuado para cribar en un gran número de compuestos su actividad moduladora de COMT.

En un primer objeto, la presente invención proporciona un procedimiento para la identificación de un modulador de la actividad de una enzima catecol O-metiltransferasa (COMT) que comprende las etapas de:

a) proporcionar 4-nitrocatecol ligado covalentemente con Alexa Fluor 488 que tiene la fórmula I,

b) poner en contacto la molécula de la etapa a) con una enzima catecol O-metiltransferasa (COMT), S- adenosllmetllonina (SAM) y un compuesto candidato y

c) medir la lectura de fluorescencia de la mezcla de la etapa b), en la que una lectura de fluorescencia alterada en presencia del compuesto candidato en comparación con un blanco es indicativa de un modulador de una enzima catecol O-metiltransferasa (COMT).

O

**(Ver fórmula)**

En una realización preferida, el procedimiento es un procedimiento para la identificación de un inhibidor de COMT, en el que la lectura de fluorescencia reducida en la etapa c) en comparación con un blanco es indicativa de un inhibidor de COMT.

En una realización preferida adicional, la lectura de fluorescencia en la etapa c) es una lectura cinética.

En una realización preferida adicional, la COMT es COMT humana.

En una realización preferida adicional, el procedimiento es un procedimiento de cribado de alto rendimiento.

En una realización preferida adicional, el procedimiento se efectúa en una placa de microvaloración.

En una realización preferida adicional, la concentración final de COMT es de aproximadamente 25 nM.

En una realización preferida adicional, la concentración final del sustrato de COMT es de aproximadamente 200 nM.

En una realización preferida adicional, la concentración final de SAM es de aproximadamente 500 nM.

En un segundo objeto, la presente invención proporciona un procedimiento para la identificación de un sustrato de una enzima catecol O-metiltransferasa (COMT) que comprende las etapas de:

a) proporcionar 4-nitrocatecol ligado covalentemente con Alexa Fluor 488 que tiene la fórmula I y S- adenosilmetionina (SAM),

b) poner en contacto la mezcla de la etapa a) con diferentes concentraciones de un compuesto candidato,

c) poner en contacto las mezclas de las etapa b) con una enzima catecol O- metiltransferasa (COMT) y

d) medir la lectura de fluorescencia cinética de las mezclas de la etapa c), en la que una meseta de lectura de fluorescencia descendente en función de una concentración creciente del compuesto candidato es indicativa de un sustrato de la enzima catecol O-metiltransferasa (COMT).

O

**(Ver fórmula)**

l _ I

° ° (I)

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra la estructura química de Alexa Fluor® 488 acoplado covalentemente con 4-nitrocatecol.

La Fig. 2 muestra una gráfica de Stern Volmer para nitrocatecol (azul), 2-metoxi-5-nitrofenol (rojo) y 1,2-dimetoxi-4- nitrobenceno (verde); se mezcló Alexa Fluor 488 libre 20 nM con altas concentraciones, hasta 25 mM, de nitrocatecol, 2-metoxi-5-nitrofenol y 1,2-dimetoxi-4-nitrobenceno, respectivamente. Solo con nitrocatecol se observa un cambio de la intensidad de fluorescencia (l0/l) de Alexa Fluor® 488, los productos metilados no influyen en la intensidad de fluorescencia de Alexa Fluor® 488.

La Fig. 3 muestra la cinética enzimática de la metilación catalizada por COMT de Alexa Fluor 488-nitrocatecol en el ensayo de fluorescencia de la presente invención.

La Fig. 4a muestra una medida cinética del cambio de la intensidad de fluorescencia en presencia de diversas concentraciones del inhibidor de COMT tolcapona.

La Fig. 4b muestra la curva de dosis-respuesta de tolcapona calculada a partir de las pendientes de la medida

cinética de la Fig. 3a.

La Fig. 5 muestra el ensayo fluorescente en presencia de dopamina, un sustrato natural de COMT. Se alcanzaron mesetas descendientes con concentraciones crecientes de dopamina. Como la dopamina es un sustrato, está metilado así como el sustrato Alexa Fluor® 488-nitrocatecol. La disponibilidad de SAM es limitada (500 nM) así que, a altas concentraciones de dopamina, el sustrato no puede metilarse ya completamente.

La Fig. 6 muestra las curvas de dosis-respuesta para un sustrato con concentraciones baja (500 nM) y alta (200 pM) de SAM y para cada concentración de SAM con y sin una preincubación de 1 hora de compuesto y SAM antes de añadir el sustrato Alexa Fluor® 488-nitrocatecol. La preincubación con poco SAM desplaza la curva de dosis- respuesta a una menor Cl50 debido a que el compuesto consume la SAM. A altas concentraciones de SAM, no hay diferencia entre con y sin preincubación, porque la SAM no es limitante y la curva de dosis-respuesta se desplaza a una mayor CI50 en comparación con la baja SAM, porque el compuesto se consume.

La Fig. 7 muestra curvas de dosis-respuesta con concentraciones baja (500 nM) y alta (200 pM) de SAM de nuevo con y sin preincubación de 1 hora del compuesto con SAM o un compuesto competitivo con SAM. Para un

compuesto competitivo con SAM, actuar con y sin preincubación no afecta a la CI50 para cada concentración de SAM, pero con alta concentración de SAM, la Cl50 se desplaza a valores mayores.

Descripción detallada de la invención

El ensayo de la presente invención está basado en los hallazgos de que un tinte fluorescente acoplado covalentemente con un sustrato de COMT, p.ej. Alexa Fluor® 488 ligado covalentemente con nitrocatecol, muestra una fluorescencia reducida debido al apagamiento Intramolecular y que la metllación del sustrato de COMT por COMT en el complejo de sustrato de COMT-tlnte fluorescente anula el apagamiento de la fluorescencia, concretamente la metllación del sustrato de COMT en el complejo de sustrato de COMT-tinte fluorescente, conduciendo a una fluorescencia aumentada en comparación con el complejo no metilado.

El término "COMT" se usa en la presente memoria para hacer referencia a una secuencia nativa de COMT de cualquier especie animal, p.ej. mamíferos incluyendo seres humanos, y a variantes de COMT (que se definen adlclonalmente a continuación). Los polipéptidos de COMT pueden aislarse de una variedad de fuentes, incluyendo tipos de tejido humano o se preparan mediante procedimientos recomblnantes y/o sintéticos.

Puede usarse en... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para la identificación de un modulador de la actividad de la enzima catecol O- metiltransferasa (COMT) que comprende las etapas de:

a) proporcionar 4-nitrocatecol ligado covalentemente con Alexa Fluor 488 que tiene la fórmula I,

b) poner en contacto la molécula de la etapa a) con una enzima catecol O-metiltransferasa (COMT), S- adenosilmetionina (SAM) y un compuesto candidato y

c) medir la lectura de fluorescencia de la mezcla de la etapa b), en el que una lectura de fluorescencia alterada en presencia del compuesto candidato en comparación con un blanco es indicativa de un modulador de enzima catecol O-metiltransferasa (COMT).

O

**(Ver fórmula)**

I I

O" o

(D-

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento es un procedimiento para la identificación de un inhibidor de COMT y una lectura de fluorescencia reducida en la etapa c) en comparación con un blanco es indicativa de un inhibidor de COMT.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la lectura de fluorescencia en la etapa c) es una lectura cinética.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la COMT es COMT humana.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento es un procedimiento de cribado de alto rendimiento.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento se efectúa en una placa de microvaloración.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración final de COMT es de aproximadamente 25 nM.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración final del sustrato de COMT es de aproximadamente 200 nM.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración final de SAM es de aproximadamente 500 nM.

10. Un procedimiento para la identificación de un sustrato de una enzima catecol O-metiltransferasa (COMT) que comprende las etapas de:

a) proporcionar 4-nitrocatecol ligado covalentemente con Alexa Fluor 488 que tiene la fórmula I y S- adenosilmetionina (SAM),

b) poner en contacto la mezcla de la etapa a) con diferentes concentraciones de un compuesto candidato,

c) poner en contacto las mezclas de la etapa b) con una enzima catecol-O-metiltransferasa (COMT) y

d) medir la lectura de fluorescencia cinética de las mezclas de la etapa c), en el que una meseta de lectura de fluorescencia descendente en función de una concentración creciente del compuesto candidato es indicativa de un sustrato de la enzima catecol O-metiltransferasa (COMT).

**(Ver fórmula)**

 

Patentes similares o relacionadas:

Kit de reactivos utilizado para detectar gastrina-17 y método de preparación y aplicación para el kit de reactivos, del 15 de Julio de 2020, de Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co., Ltd: Un kit para detectar gastrina-17, caracterizado porque comprende un componente A y un componente B, en donde el componente A es un primer […]

Inmunoensayos de canalización de oxígeno luminiscentes heterogéneos, del 15 de Julio de 2020, de SIEMENS HEALTHCARE DIAGNOSTICS INC.: Un kit que contiene un sistema de deteccion quimioluminiscente, comprendiendo el kit: (a) una composicion que comprende un compuesto quimioluminiscente activable […]

Determinación de enriquecimientos de trazadores de glucosa mediante espectrometría de masas, del 13 de Mayo de 2020, de Medizinische Universität Graz: Procedimiento para determinar, en una muestra, los enriquecimientos de un primer y, por lo menos, un segundo trazador marcado de una forma […]

Compuestos de tienopirrol y usos de los mismos como inhibidores de luciferasas procedentes de Oplophorus, del 6 de Mayo de 2020, de PROMEGA CORPORATION: Un compuesto de fórmula (I), o una sal del mismo: **(Ver fórmula)** en la que: la línea discontinua representa la presencia o ausencia de un enlace; X es […]

Etiqueta de epítopo y método de detección, captura y/o purificación de polipéptidos etiquetados, del 15 de Abril de 2020, de ChromoTek GmbH: Péptido epítopo aislado que tiene de 12 a 25 aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia según se define en SEQ ID NO: 32 (X1X2RX4X5AX7SX9WX11X12), […]

Nanomateriales multicomponentes de Au y métodos de síntesis, del 15 de Abril de 2020, de THE CURATORS OF THE UNIVERSITY OF MISSOURI: Una nanoconstrucción de AuNP(DTDTPA)(biomolécula) que comprende una nanopartícula (NP) de Au, DTDTPA y una biomolécula, en donde DTDTPA es ácido dietilentriaminopentaacético […]

Tira para monitorizar concentraciones de analito, del 8 de Abril de 2020, de Biostrip ApS: Un procedimiento para medir la concentración de al menos un analito C en una muestra líquida, consistiendo dicho procedimiento en: i) aplicar una muestra […]

Ensayo para capturar y detectar células de mieloma múltiple circulantes de la sangre, del 25 de Marzo de 2020, de Menarini Silicon Biosystems S.p.A: Un método para capturar, aislar y analizar células de mieloma múltiple circulantes en una muestra de sangre obtenida de un sujeto de prueba que comprende (a) […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .