GRK2 Terapia Antitumoral.Empleo de siRNA para la inhibición de la expresión de GRK2 como terapia antitumoral en cánceres en los que la AKT esté cooperando con GRK2 en la adquisición de las características tumorales.

Empleo de este siRNA como agente terapéutico en el tratamiento del melanoma, y cáncer de mama

GRK2 terapia antitumoral.

La presente invención pertenece al campo de la biología, biología molecular y bioquímica. Se dirige a la regulación de la expresión de GRK2 para el tratamiento del melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, gliomas y cáncer de tiroides.

Antecedentes de la invención

Las quinasas de receptores acoplados a proteínas G (GRKs - G protein-coupled receptor kinases) participan, junto con las arrestinas, en los procesos de regulación de múltiples receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de gran relevancia fisiológica y farmacológica. Estas proteínas forman una familia de siete miembros (GRK1-GRK7) que fosforilan específicamente receptores activados por agonista en residuos de serina/treonina, promoviendo procesos de internalización, reciclaje y/o degradación de GPCRs en combinación con las β-arrestinas (Fig. 1). Las proteínas GRKs poseen además otros sustratos de membrana no GPCRs, así como sustratos citosólicos que diversifican las consecuencias funcionales de la actividad de estas quinasas. Asimismo, se han identificado numerosas moléculas con las que las GRKs interaccionan de modo independiente de la actividad quinasa (Pao, 2002; Ribas, 2007), lo cual pone de manifiesto la existencia de funciones "scaffold" o de andamiaje para esta familia de proteínas.

Dado que los GPCR modulan procesos celulares básicos (diferenciación, migración, ciclo celular, respuestas antiapoptóticas) con frecuencia su actividad se halla involucrada en el origen y desarrollo de tumores de distinta naturaleza (Dorsam, 2007). Así, potentes mitógenos como trombina, S1P, LPA, sonic hedgehod o endotelina regulan la proliferación en células tumorales y sus receptores se hallan sobreexpresados en varios tipos de cáncer (colon, mama, próstata, melanoma). Asimismo, receptores de quimioquinas como CXCR4 o CXCR2 desempeñan un papel central en la metástasis tumoral. Las células tumorales que sobreexpresan estos receptores son activadas por quimioquinas liberadas por células estromales, macrófagos y leucocitos infiltrados en el tumor, estimulando la motilidad y supervivencia de las células cancerosas.

Dado que la señalización de los receptores GPCRs en contextos tumorales exhibe frecuentemente cambios, bien como consecuencia de una amplificación en los niveles de expresión de los mismos, bien como resultado de alteraciones en los mecanismos de regulación de su funcionalidad conducentes a una ganancia de función, es de interés general analizar los procesos que modulan a su vez la actividad de las moléculas reguladoras de estos receptores. En este sentido la proteína GRK2, que es la más ubicua y mejor caracterizada isoforma de la familia de GRKs, se perfila como una molécula clave en la señalización celular con un gran potencial fisiopatológico en contextos tumorales, ya que no sólo regularía la actividad de distintos GPCRs implicados en cáncer, sino también de proteínas citosólicas implicadas en vías de señalización proliferativas y de supervivencia (p38, Smads, entre otras), así como de proteínas de membrana no GPCRs con potencial oncogénico (receptor de EGF). Asimismo, GRK2 es capaz de modular diversas proteínas como por ejemplo PI3K, ERK o GIT1 de manera independiente de fosforilación, sugiriendo que posee propiedades de proteína adaptadora o "scaffold" (Fig. 2). Dada la compleja diversidad funcional de GRK2, existen en la célula sofisticados mecanismos que regulan tanto la actividad de la quinasa como sus niveles de expresión, cuya alteración se asocia a situaciones patológicas. Así, el estudio de los procesos que regulan la estabilidad y funcionalidad de GRK2, ha revelado que cambios en la estabilidad de la proteína y/o en su funcionalidad tienen repercusiones directas en la fisiología celular, mostrando la participación de GRK2 en la migración celular y en procesos de transformación neoplásica.

Descripción de la invención

La presente invención se enfrenta con el problema de inhibir la acción de la GRK2, no sólo a nivel de su actividad serina-treonina kinasa, sino de sus funciones "scaffold". Así, la supresión de la expresión de GRK2 en las enfermedades cancerosas en las que esta proteína se encuentra sobreexpresada, y en las que está contribuyendo o cooperando con AKT en la adquisición y mantenimiento de las características tumorales, sería una terapia apropiada.

En este sentido, la presente invención proporciona una secuencia de ribonucleótidos o RNA que pertenece al denominado siRNA (small interfering RNA), ARN pequeño de interferencia o ARN de silenciamiento, capaz de inhibir la expresión genética de la proteína GRK2 (de aquí en adelante siRNA de la invención), proporcionando nuevas técnicas eficaces contra la proliferación y la migración celular, relacionadas con el cáncer. La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han observado que es posible la inhibición de la proliferación y migración celular en determinados tipos de cáncer, mediante el uso de una molécula de RNA de secuencia concreta que se une al ARN mensajero que codifica para la proteína GRK2 impidiendo su traducción y por tanto inhibiendo su expresión. Así, el empleo de siRNA, tal y como se describe en esta memoria, permite la inhibición de la expresión de GRK2 en patologías tumorales en las que la proteína GRK2 se halla sobre-expresada como resultado de una amplificación funcional de la vía de señalización dependiente de PI3K, contribuyendo a la transformación tumoral y cooperando -con Akt.

Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición (de aquí en adelante composición de la invención) que comprende un siRNA capaz de inhibir la proliferación y migración celular basado en la inhibición de la expresión de la proteína GRK2, para su uso en aquellos contextos patológicos en los que el GRK2 esté contribuyendo o cooperando con AKT en la adquisición o mantenimiento de características tumorales.

Una realización preferida de la invención, lo constituye una composición de la invención que comprenda una construcción de RNA (construcción de RNA de la invención) que al menos contenga una cualquiera de las secuencias de nucleótidos posibles de siRNA capaces de inhibir la expresión de GRK2, y sin perjuicio de que adicionalmente formen parte de la presente invención cualquiera de las secuencias y construcciones de RNA de la invención anteriormente descritas que sean objeto de modificaciones, preferentemente químicas, que conduzcan a una mayor estabilidad frente a la acción de ribonucleasas y con ello a una mayor eficiencia. Sin que dichas modificaciones supongan la alteración de su mecanismo de acción, que es la unión específica al complejo RISC (RNA-induced silencing complex), activándolo y manifestando una actividad helicasa que separa las dos hebras dejando solo la hebra antisentido asociada al complejo. El complejo ribonucleoprotéico resultante se une al mRNA diana (ARN mensajero del GRK2). Si la complementariedad no es perfecta, RISC queda asociado al mensajero y se atenúa la traducción. Pero si es perfecta, RISC actúa como RNasa, cortando al mensajero y quedando libre para repetir el proceso.

La composición de la presente invención se utiliza en el tratamiento de aquellos tipos de cáncer, en los que se ha observado que la proteína GRK2 se encuentra cooperando con la AKT, como son el melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, gliomas y cáncer de tiroides.

La preparación de la secuencia de siRNA de la invención o de la construcción de RNA de la invención sería evidente para un experto en la materia, y se podría llevar a cabo por síntesis química, lo cual permite además la incorporación de modificaciones químicas tanto en los distintos nucleótidos del producto como la incorporación de otros compuestos químicos en cualquiera de los extremos. Por otro lado, la síntesis también podría realizarse enzimáticamente utilizando cualquiera de las RNA polimerasas disponibles. La síntesis enzimática también permite alguna modificación química de los productos o RNAs inhibidores.

El diseño de la secuencia de nucleótidos del siRNA de la invención también sería evidente para un experto en la materia. Así, se podría realizar mediante un diseño aleatorio en el que se seleccionen 19-21 bases del ARNm diana sin tener en cuenta la secuencia o la información posicional que tiene en el transcrito. Otra alternativa no limitativa...

1. Uso de una composición que comprende un siRNA que puede ser obtenido a partir de la secuencia del RNA mensajero de GRK2, capaz de inhibir la expresión del gen GRK2, para la elaboración de un medicamento.

2. Uso de una composición que comprende un siRNA obtenido a partir de la secuencia del RNA mensajero de GRK2, capaz de inhibir la expresión del gen GRK2, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cancerígenas.

3. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el siRNA comprende la SEQ ID NO: 2.

4. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el siRNA se encuentra fusionado a aptámeros.

5. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el siRNA se encuentra incluido en una construcción genética de RNA.

6. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el siRNA está incluido en una construcción genética de DNA capaz de transcribirse in vitro ó in vivo a una secuencia de RNA.

7. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 2-6, donde la enfermedad cancerígena se caracteriza porque GRK2 se encuentra cooperando con AKT.

8. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 2-7, donde la enfermedad cancerígena se selecciona de la lista que comprende: melanoma y cáncer de mama.

9. Uso de una composición según la reivindicación 8, donde la enfermedad cancerígena es el melanoma.

10. Uso de una composición según la reivindicación 8, donde la enfermedad cancerígena es el cáncer de mama.