Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica MiRP1 humano indicado en la SEC ID Nº: 2 o su complementaria

Genes relacionados con MinK, formación de canales de potasio y asociación con arritmias cardiacas.

Esta solicitud se hizo con apoyo gubernamental conforme a las becas nº RO1 HL46401, RO1 GM51851 y P50-HL52338, financiadas por los Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, Maryland y la beca M01 RR00064 del Servicio de Salud Pública de Estados Unidos. El gobierno federal puede tener ciertos derechos en esta invención.

Antecedentes de la invención

La presente invención está relacionada con genes y productos génicos relacionados con Min-K, que forma canales iónicos, y con un proceso para el diagnóstico de trastornos de canales iónicos, incluyendo el síndrome de QT largo (LQT). Por ejemplo, la proteína KCNE2 forma canales de potasio I_Kr junto con HERG y está asociada con el LQT. El LQT se diagnostica según la presente invención analizando la secuencia de ADN de KCNE2 de un individuo a ensayar y comparando la secuencia de ADN respectiva con la secuencia de ADN conocida de un gen KCNE2 normal. Como alternativa, estos genes relacionados con MinK de un individuo a ensayar pueden explorarse con respecto a mutaciones que producen trastornos de canales iónicos, incluyendo el LQT. La predicción de trastornos de canales iónicos, incluyendo el LQT, permitirá a los expertos prevenir los trastornos usando la terapia médica existente. Esta invención está relacionada además con el descubrimiento de que las proteínas HERG y KCNE2 (también conocidas como MiRP1) se ensamblan para formar un canal de potasio I_Kr cardiaco. Este conocimiento puede usarse para coexpresar estas dos proteínas en una célula, y dicha célula transformada puede usarse para seleccionar fármacos que sean útiles en el tratamiento o prevención del LQT. La invención está relacionada además con mutaciones en el gen KCNE2 humano que se han descubierto en familias con LQT.

Las publicaciones y otros materiales usados en el presente documento para aclarar los antecedentes de la invención o proporcionar detalles adicionales con respecto a la práctica se incorporan como referencia, y por comodidad se agrupan respectivamente en la Lista de Referencias adjunta.

Las arritmias cardiacas son una causa común de morbilidad y mortalidad, siendo responsables de aproximadamente el 11% de todas las muertes naturales (Kannel; 1987; Willich et al., 1987). En general, el diagnóstico y el tratamiento presintomático de individuos con taquiarritmias ventriculares que ponen en peligro la vida es deficiente y en algunos casos el tratamiento médico realmente aumenta el riesgo de arritmia y muerte (Cardiac Arhythmia Suppression Trial II Investigators, 1992). Estos factores hacen que la detección precoz de individuos con riesgo de arritmias cardiacas y la prevención de las arritmias sean altas prioridades.

Tanto los factores genéticos como los factores adquiridos contribuyen al riesgo de desarrollar arritmias cardiacas. El síndrome de QT largo (LQT) es una arritmia cardiaca hereditaria que produce una pérdida brusca de consciencia, síncope, ataques y muerte súbita por taquiarritmias ventriculares, específicamente torsade de pointes y fibrilación ventricular (Ward, 1964; Romano, 1965; Schwartz et al., 1975; Moss et al., 1991). Este trastorno normalmente se produce en individuos jóvenes, por lo demás sanos (Ward, 1964; Romano 1965; Schwartz et al., 1975). La mayoría de los portadores de genes del LQT manifiestan una prolongación del intervalo QT en un electrocardiograma, un signo de una repolarización cardiaca anómala (Vincent et al., 1992). Las características clínicas del LQT se producen como resultado de arritmias cardiacas episódicas, específicamente taquiarritmias ventriculares relacionadas con la repolarización tales como torsade de pointes, denominada así por la naturaleza ondulante característica del electrocardiograma en esta arritmia y fibrilación ventricular (Schwartz et al., 1975; Moss and McDonald, 1971). La arritmia conocida como torsade de pointes puede degenerar en fibrilación ventricular, una arritmia particularmente letal. Aunque el LQT no es un diagnóstico común, las arritmias ventriculares son muy comunes; más de 300.000 ciudadanos de Estados Unidos mueren repentinamente cada año (Kannel, et al., 1987; Willich et al., 1987) y, en muchos casos, el mecanismo subyacente puede ser una repolarización cardiaca aberrante. Por lo tanto, el LQT proporciona una oportunidad única para estudiar a nivel molecular las arritmias cardiacas que ponen en peligro la vida.

Se han definido tanto formas hereditarias como formas adquiridas de LQT. El LQT adquirido y las arritmias secundarias pueden producirse por isquemia cardiaca, bradicardia y anomalías metabólicas tales como bajas concentraciones séricas de potasio o calcio (Zipes, 1987). El LQT también puede producirse por tratamiento con ciertas medicaciones, incluyendo antibióticos, antihistamínicos, anestésicos generales y, la mayoría de las veces, medicaciones antiarrítmicas (Zipes, 1987). Las formas hereditarias de LQT pueden deberse a mutaciones en al menos cinco genes diferentes. En estudios previos se localizaron loci de LQT en el cromosoma 11p15.5 (KVLQTI o LQT1) (Keating et al., 1991a; Keating et al; 1991b), 7q35-36 (HERG o LQT2) y 3p21-24 (SCN5A o LQT3) (Jiang et al., 1994). De éstos, la causa más común de LQT hereditario es KVLQT1. Los datos de los presentes solicitantes indican que las mutaciones en este gen son responsables de más de un 50% del LQT hereditario. Recientemente se localizó un cuarto locus de LQT (LQT4) en 4q25-27 (Schott et al., 1995). Además, KCNE1 (LQT5) se ha asociado con el síndrome de QT largo (Splawski et al., 1997b; Duggal et al., 1998). Estos genes codifican canales iónicos implicados en la generación del potencial de acción cardiaco. Las mutaciones pueden ocasionar una disfunción de los canales y retrasar la repolarización miocelular. Debido a la heterogeneidad regional de la expresión de los canales con el miocardio, la repolarización cardiaca aberrante crea un sustrato para la arritmia. KVLQT1 y KCNE1 también se expresan en el oído interno (Neyroud et al., 1997; Vetter et al., 1996). Los presentes solicitantes y otros investigadores demostraron que ciertas mutaciones homocigotas o heterocigotas compuestas en cada uno de estos genes pueden producir sordera y el fenotipo cardiaco severo del síndrome de Jervell y Lange-Nielsen (Neyroud et al., 1997; Splawski et al., 1997a; Schultze-Bahr et al., 1997; Tyson et al., 1997). La pérdida de canales funcionales en el oído aparentemente altera la producción de endolinfa, produciendo sordera.

El diagnóstico presintomático del LQT actualmente se basa en la prolongación del intervalo QT en electrocardiogramas. Un valor de QTc (intervalo QT corregido para el ritmo cardiaco; Bazzett, 1920) mayor de 0,44 segundos ha clasificado tradicionalmente a un individuo como afectado. Sin embargo, la mayoría de los pacientes con LQT son individuos jóvenes, por lo demás sanos, que no se someten a electrocardiogramas. Además, los estudios genéticos han demostrado que el valor de QTc ni es sensible ni es específico (Vincent et al., 1992). El espectro de intervalos QTc para portadores de genes y no portadores solapa, lo cual conduce a clasificaciones erróneas. Los no portadores pueden tener intervalos QTc prolongados y diagnosticarse como individuos afectados. Por el contrario, algunos portadores de genes de LQT tienen intervalos QTc =q 0,44 segundos, pero siguen teniendo un mayor riesgo de arritmia. Un diagnóstico presintomático correcto es importante para un tratamiento eficaz y con especificidad génica del LQT.

Se ha informado sobre formas autosómicas dominantes y autosómicas recesivas de este trastorno. El LQT autosómico recesivo (también conocido como síndrome de Jervell y Lange-Nielsen) se ha asociado con una sordera neural congénita; esta forma de LQT es rara (Jervell y Lange-Nielsen, 1957). El LQT autosómico dominante (síndrome de Romano-Ward) es más común y no está asociado con otras anomalías fenotípicas (Romano et al., 1963; Ward, 1964). Un trastorno muy similar al LQT hereditario también puede ser adquirido, normalmente como resultado de una terapia farmacológica (Schwartz et al., 1975; Zipes, 1987).

Los datos tienen implicaciones para el mecanismo de las arritmias en el LQT. Previamente se han propuesto dos hipótesis para el LQT (Schwartz et al., 1994). Una sugiere que una predominancia de la inervación...

1. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica MiRP1 humano indicado en la SEC ID Nº: 2 o su complementaria.

2. Polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2.

3. Procedimiento de amplificación de un exón de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2, donde dicho procedimiento comprende usar un par de cebadores.

4. Vector que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 1.

5. Célula transfectada con el vector de la reivindicación 4.

6. Animal transgénico no humano que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 1.

7. Procedimiento para evaluar el riesgo de un individuo de padecer el síndrome de QT largo, que comprende explorar el individuo en relación con una mutación en MiRP1 comparando la secuencia de MiRP1 o sus productos de expresión aislados de una muestra de tejido de dicho individuo con una secuencia de tipo salvaje de MiRP1 o sus productos de expresión, donde la secuencia de tipo salvaje de MiRP1 codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2, donde una mutación en la secuencia del individuo indica un riesgo de síndrome de QT largo.

8. Procedimiento de cribaje de fármacos que sean útiles en el tratamiento o prevención del síndrome de QT largo, dicho procedimiento comprendiendo:

(a) poner células que expresan HERG de tipo salvaje y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 en una solución de baño para medir la corriente;

(b) medir la corriente de K⁺ inducida en las células de la etapa (a);

(c) poner las células que expresan HERG mutante y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 en una solución de baño para medir la corriente;

(d) medir la corriente de K⁺ inducida en las células de la etapa (c);

(e) añadir un fármaco a la solución de baño de la etapa (c);

(f) medir una corriente de K⁺ inducida en las células de la etapa (e); y

(g) determinar si el fármaco produjo una corriente de K⁺ inducida más similar o menos similar a la corriente de K⁺ inducida observada en las células que expresan HERG de tipo salvaje y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 en comparación con la corriente observada en células que expresan HERG mutante y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 en ausencia de un fármaco,

donde un fármaco que produce una corriente más similar a la corriente observada en las células que expresan HERG de tipo salvaje y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 es útil en el tratamiento o prevención del síndrome de QT largo.

9. Procedimiento de la reivindicación 8, en el que: i) dichas células de la etapa (a) se cotransfectan con HERG de tipo salvaje y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2, ii) dichas células de la etapa (c) se cotransfectan con HERG mutante y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2, o iii) dichas células de la etapa (a) se cotransfectan con HERG de tipo salvaje y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 y dichas células de la etapa (c) se cotransfectan con HERG mutante y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2.

10. Procedimiento de la reivindicación 8, en el que: i) dichas células de la etapa (a), ii) dichas células de la etapa (c) o iii) dichas células de las etapas (a) y (c) se transfectan con ARN.

11. Procedimiento de cribaje de fármacos que sean útiles en el tratamiento o prevención del síndrome de QT largo, dicho procedimiento comprendiendo:

(a) preparar un animal transgénico no humano cotransfectado con HERG de tipo salvaje y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2;

(b) medir la corriente de K⁺ inducida en el animal transgénico de la etapa (a);

(c) preparar un animal transgénico no humano cotransfectado con HERG de tipo mutante y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2;

(d) medir la corriente de K⁺ inducida en el animal transgénico de la etapa (c);

(e) administrar un fármaco al animal transgénico de la etapa (c);

(f) medir la corriente de K⁺ inducida en el animal tratado con fármaco de la etapa (e);

(g) determinar si el fármaco produjo una corriente de K⁺ inducida más similar o menos similar a la corriente de K⁺ inducida observada en el animal transgénico cotransfectado con HERG de tipo salvaje y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 en comparación con la corriente observada en un animal transgénico cotransfectado con HERG mutante y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 en ausencia de fármaco,

donde un fármaco que produce una corriente más similar a la corriente observada en animales transgénicos cotransfectados con HERG de tipo salvaje y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 es útil en el tratamiento o prevención del síndrome de QT largo.

12. Animal transgénico no humano, donde dicho animal comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 y un HERG humano mutante.

13. Procedimiento para determinar la capacidad de un fármaco de afectar a la corriente de potasio rectificadora retardada rápida (I_Kr), dicho procedimiento comprendiendo:

a) poner células que expresan HERG mutante y un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido indicado en la SEC ID Nº: 2 en una solución de baño para medir la corriente;

b) medir o detectar una primera corriente de K⁺ inducida en las células de la etapa (a);

c) añadir un fármaco a la solución de baño de la etapa (a);

d) medir una segunda corriente de K⁺ inducida en las células de la etapa (c); y

e) determinar si la adición de dicho fármaco en la etapa (c) inhibe, aumenta o altera el I_Kr comparando dicha primera corriente de K⁺ inducida con dicha segunda corriente de K⁺ inducida.