EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN CÉLULAS ENDOTELIALES DERIVADAS DE SANGRE UMBILICAL.

Expresión de proteínas en células endoteliales derivadas de sangre umbilical La invención se refiere a un procedimiento para la producción de una proteína, por ejemplo, un factor de coagulación sanguínea. El procedimiento comprende cultivar células endoteliales derivadas de sangre umbilical humana y aislar la proteína deseada a partir del medio de cultivo celular. La solicitud describe adicionalmente una población de células endoteliales humanas transducidas con un vector que codifica una proteína, por ejemplo, un factor de coagulación sanguínea. Las células pueden usarse en el procedimiento para la producción de una proteína o en un protocolo de terapia génica. La hemofilia A está causada por niveles insuficientes o incluso la ausencia completa del factor de coagulación VIII (FVIII) funcional en la circulación. Es un trastorno hemorrágico ligado al cromosoma X que afecta a 1 de cada 5.000 a 10.000 varones. El FVIII es un componente esencial de la vía intrínseca de la cascada de coagulación sanguínea, donde sirve como cofactor para el factor IX activado dentro de un complejo unido a membrana (complejo Xasa) que activa el factor X, que a su vez participa en la conversión del zimógeno protrombina en la enzima trombina. El FVIII se sintetiza como una molécula de 2332 restos aminoacídicos (~300 kDa) que consiste en tres dominios A homólogos, dos dominios C homólogos, y un dominio B único dispuestos en el orden A1-A2-B-A3-C1-C2. El FVIII se procesa por múltiples escisiones intracelulares dentro del dominio B, y en la unión B-A3, en un heterodímero que consiste en las cadenas ligera y pesada ligadas a Me 2+ . La cadena pesada está comprendida por los dominios A1 (1-336), A2 (373-740) y B (741-1648) y la cadena ligera incluye los dominios A3 (1649-2019), C1 (2020-2172) y C2 (2173-2332). En la circulación, el FVIII está ligeramente unido al factor de von Willebrand (VWF), una proteína necesaria para mantener el nivel normal de FVIII en plasma. El VWF evita la formación prematura del complejo Xasa y protege al FVIII de la inactivación por la proteína C activada, el factor IX activado (FIXa) y el factor X activado (FXa). La deficiencia de VWF tanto en seres humanos como en animales ha demostrado conducir a una deficiencia secundaria de FVIII, sugiriendo de este modo que VWF también evita que FVIII se elimine de forma acelerada. Los síntomas principales de la hemofilia A son hemorragias en las articulaciones, músculos y órganos internos, que pueden suceder de forma espontánea y ser amenazantes para la vida (Mannucci y Tuddenhem, 2001; véase infra para los datos bibliográficos de las referencias). En base a la actividad residual de FVIII en plasma, la hemofilia A se clasifica como grave (<1% de actividad normal), moderada (1-5%) y leve (5-30%). La hemofilia B existe en aproximadamente 1 de cada 25.000 varones. Se caracteriza por la deficiencia de la serín proteasa factor IX (factor de Christmas). Este polipéptido de 415 aminoácidos se sintetiza en el hígado como una glicoproteína de 56 kDa. Para obtener su función apropiada es necesaria una etapa de carboxilación posttraduccional que solamente sucede en presencia de vitamina K. Los pacientes con hemofilia A y B actualmente se tratan por infusiones intravenosas de FVIII y FIX derivados de plasma o recombinantes, respectivamente (Mannucci y Giangrande, 2000). Aunque esta terapia de sustitución ha llegado a ser relativamente segura y eficaz durante la última década, hay varios inconvenientes tales como la inconveniencia de infusiones a lo largo de la vida y la transmisión potencial de enfermedades infecciosas por los concentrados de FVIII (Hoots, 2001; Teitel, 2000; White II y col., 2000; VandenDriessche y col., 2001). Debido a la semivida relativamente corta de FVIII en la circulación (12-14 h), el tratamiento profiláctico de la hemofilia A requiere infusiones repetidas - hasta tres veces a la semana - de preparaciones de FVI. El uso de líneas celulares no humanas para la producción de factor VIII recombinante encontró ciertas desventajas. La limitación principal en la producción de FVIII recombinante es el bajo rendimiento a partir de células que expresan FVIII, que es dos órdenes de magnitud inferior a la de otras proteínas. Se realizaron varios estudios in vivo para la terapia génica de la hemofilia A con vectores virales y no virales (revisados en White II, 2001; Chuah y col., 2001; Greengard y Jolly 1999, VandenDriessche y col., 2001; Kaufman, 1999). Sin embargo, siguen existiendo preocupaciones sobre la seguridad de estos enfoques. Los efectos secundarios potenciales incluyen reacciones inmunológicas adversas, citotoxicidad mediada por el vector (Yang y col., 1996; Lozier y col., 1999) y transmisión en la línea germinal. En condiciones fisiológicas, la síntesis de FVIII sucede principalmente en los hepatocitos y en las células endoteliales sinusoidales del hígado (Wion y col., 1985; Zelechowska y col., 1985; Do y col., 1999; Hollestelle y col., 2001). Estos y otros tipos celulares tales como piel (Hoeben y col., 1990; Fakharzadeh y col., 2000), células endoteliales (Dwarki y col., 1995; Chuah y col., 1995; Rosenberg y col., 2000), hepatocitos (Andrews y col., 1999), células estromáticas de médula ósea (Chuah y col., 1998) y células hematopoyéticas (Hoeben y col., 1992; Evans y Morgan, 1998; Tonn y col., 2002) pueden ser útiles en enfoques terapéuticos génicos. De hecho, el implante de fibroblastos modificados ex vivo que secretaban FVIII demostró tolerarse bien y conducir a niveles plasmáticos detectables de FVIII en pacientes con hemofilia A grave (Roth y col., 2001). La solicitud de patente de Estados Unidos 2002/0042130 A1 y Lin y col. (2002) describen estudios sobre el uso de células endoteliales del torrente sanguíneo (BOEC) para terapia génica para la hemofilia A. Gehling y col. (2000) informan de la diferenciación in vitro de células endoteliales a partir de células progenitoras AC133-positivas. Gehling y col. no describen, sin embargo, la transducción de células con ADN codificante del factor VIII. Los 2 ES 2 366 092 T3 documentos EP 1 136 553 A1 y WO 01/70968 A2 se refieren a la producción de factores de coagulación sanguínea recombinantes en líneas celulares humanas inmortalizadas. Rosenberg y col. (2000) "Arteriosclerosis, thrombosis and vascular biology" 20, 2689-2695 describen la transducción del gen VIII con el dominio B delecionado en células endoteliales de vena umbilical humana primarias (HUVEC). Estas células recubren la pared interior de la vena umbilical y por tanto representan células endoteliales completamente diferenciadas que muestran potencial proliferativo muy limitado. Rosenbreg y col. no describen el uso de células derivadas de sangre umbilical, es decir, sangre residual placentaria. Las células descritas por Rosenberg y col. difieren de las células endoteliales de sangre umbilical en su fenotipo y potencial proliferativo. Ferrari y col., (2003), Gene Therapy 10, 647-656 describe estudios sobre células tipo progenitores endoteliales derivados de médula ósea como vectores de direccionamiento génico selectivos para la angiogénesis. Las células descritas en Ferrari y col. expresan ß-gal, GFP o timidina quinasa. El documento WO 02/08389 A2 se refiere a la angiogénesis terapéutica por transplante de células derivadas de médula ósea en tejido isquémico miocárdico y tejido isquémico de músculo esquelético. El documento WO 03/013570 A1 se refiere a la protección por el factor de crecimiento derivado de plaquetas del miocardio cardiaco y los objetivos para proporcionar procedimientos para tratar y prevenir la pérdida de vascularización tisular que puede suceder en el envejecimiento. Las células de acuerdo con el documento WO 03/013570 A1 expresan PDGF. Müller y col., (2002) investigan la expresión de los marcadores endoteliales PECAM-1, vWf, y CD34 in vitro e in vivo. Un objeto de la presente invención es proporcionar células que sean adecuadas para producir cantidades suficientes de una proteína terapéuticamente eficaz. Un objeto adicional de la invención es proporcionar células que sean adecuadas para producir cantidades suficientes de la proteína funcional factor VIII y que puedan usarse en terapia génica. Se ha descubierto sorprendentemente que las células precursoras endoteliales derivadas de sangre umbilical humana pueden diferenciarse en células endoteliales maduras que secretan niveles elevados de factor VIII después de transducción viral con ADNc que codifica el factor VIII. La invención, por lo tanto, se refiere a un procedimiento para la preparación de células endoteliales humanas que expresan un factor de coagulación sanguínea, que comprende a) obtener células precursoras endoteliales de sangre umbilical humana; b) poner en contacto, in vitro, dichas células precursoras endoteliales derivadas de sangre... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la preparación de células endoteliales humanas que expresen un factor de coagulación sanguínea, que comprende a) obtener células precursoras endoteliales de una muestra de sangre umbilical humana: b) poner en contacto, in vitro, dichas células precursoras endoteliales derivadas de sangre umbilical humana con al menos un factor de crecimiento, en el que el al menos un factor de crecimiento promueve la diferenciación de las células precursoras endoteliales en células endoteliales maduras; y c) transducir las células endoteliales maduras con ADN que codifica el factor de coagulación sanguínea, o transducir, antes de la etapa b), las células precursoras endoteliales con ADN que codifica el factor de coagulación sanguínea. 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células precursoras endoteliales derivadas de sangre umbilical humana expresan al menos un marcador de superficie celular seleccionado entre el grupo que consiste en CD34, AC133, CD146 y FGF1-R. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en el que la etapa a) comprende enriquecer células CD34-positivas, células AC133-positivas, células CD146-positivas y/o células FGF1-R-positivas a partir de sangre umbilical. 4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se usa un vector retroviral, preferiblemente un vector lentiviral, para transducir las células. 5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el factor de coagulación sanguínea es el factor VIII humano. 6. Un procedimiento para la producción de un factor de coagulación sanguínea, que comprende a) obtener una población de células endoteliales humanas por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5; y opcionalmente generar una línea celular inmortalizada a partir de dicha población de células endoteliales humanas; b) cultivar dicha población de células endoteliales humanas o dicha línea celular en condiciones adecuadas; y c) aislar el factor de coagulación sanguínea de dicho medio de cultivo celular. 7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el factor de coagulación sanguínea es el factor VIII o IX humano de coagulación sanguínea. 8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en el que el ADN recombinante que codifica un factor de coagulación sanguínea codifica una muteína del factor VIII humano de coagulación sanguínea. 9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la muteína del factor VIII humano carece al menos parcialmente del dominio B del factor VIII de tipo silvestre. 10. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el ADN recombinante que codifica un factor de coagulación sanguínea es un ADNc del factor VIII modificado, en el que (i) se ha delecionado al menos parte del dominio B del ADNc del factor VIII de tipo silvestre, (ii) se ha insertado al menos un intrón en al menos una localización del ADNc del factor VIII, y/o (iii) está sustituido al menos un nucleótido de la secuencia de ADNc de tipo silvestre del factor VIII humano. 11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que al menos el 75% de las células expresan al menos un marcador seleccionado entre el grupo que consiste en CD144, CD31, CD146 y receptor LDL. 12. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que al menos el 75% de las células expresan VWF de forma endógena. 13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en el que el factor de coagulación sanguínea es el factor VIII de coagulación sanguínea y la etapa de aislamiento incluye purificar el factor VIII de coagulación sanguínea en presencia del factor de von Willebrand. 14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en el que el factor de coagulación sanguínea se somete a tratamiento de inactivación viral. 26 ES 2 366 092 T3 15. El uso de una población de células endoteliales humanas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la hemofilia A o la hemofilia B, comprendiendo dicho uso obtener dicha población de células endoteliales humanas por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5. 16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que las células que secretan el factor VIII humano de coagulación sanguínea se administran a un individuo que padece hemofilia A. 27 ES 2 366 092 T3 28 ES 2 366 092 T3 29 ES 2 366 092 T3 ES 2 366 092 T3 31 ES 2 366 092 T3 32 ES 2 366 092 T3 33 ES 2 366 092 T3 34