ENSAYOS DE CÉLULAS T.

Un procedimiento para medir una respuesta de células T colaboradoras a una sustancia de ensayo que comprende las siguientes etapas:

(a) aislar células que presentan antígenos (APCs) y células T de una muestra obtenida de un organismo; (b) depletar células T reguladoras de las células aisladas; (c) incubar dichas APCs y células depletadas de células T reguladoras obtenidas en el punto (b) con la sustancia de ensayo; y (d) ensayar las respuestas de células T a la sustancia de ensayo.

La presente invención se refiere a nuevos procedimientos de ensayo de células T, en particular donde las respuestas de células T a antígenos de ensayo son incrementadas por la eliminación de células T reguladoras. La presente invención también se refiere a nuevos ensayos donde el tiempo de incubación con antígenos u otras muestras es variado para optimizar la detección de respuestas de células T. En particular, la invención se refiere a ensayos de células T con muestras proteináceas donde detección óptima de epítopes de células T se logra mediante la utilización de múltiples mediciones de puntos de tiempo de la proliferación de células T o liberación de citoquina. Además, la invención se refiere a ensayos de células T donde el tiempo de incubación con antígeno con células que presentan antígenos (APCs) o células T o ambos APCs y células T se varía para optimizar la detección de epítopes de células T. La invención particularmente se refiere a ensayos de células T con muestras inmunomoduladoras o tóxicas que directamente afectan las APCs, células T o ambas APCs y células T. La invención tiene aplicación particular para la medición de respuestas de células T humanas a productos farmacéuticos, alérgenos, irritantes u otras sustancias contactadas por el hombre.

Los ensayos de células T proporcionan un procedimiento efectivo para medir las respuestas de células T a antígenos y otras muestras, especialmente en seres humanos. Dichos ensayos son considerados como ensayos "ex vivo" donde las muestras sanguíneas son tomadas de dadores y procesadas de manera tal que se utilizan cultivos primarios de células sanguíneas directamente en dichos ensayos. Para las muestras proteináceas y peptídicas, se han utilizado ensayos de células T humanas ex vivo para detectar epítopes de células T humanas para varios fines incluyendo la evaluación de la potencial inmunogenicidad de dichas muestras en hombre (Jones et al., l., J. Interferon Cytokine Res., volumen 24 (2004) p560-572), lo que define epítopes de células T dentro de una secuencia proteica para la posterior inclusión en vacunas, y lo que define epítopes de células T dentro de una secuencia proteica para la eliminación posterior para evitar la inmunogenicidad (Jones et al., J. , Interferon Cytokine Res., volumen 24 (2(2004) página 560572, y Jones et al, Ja Thromb. Haemost., volumen 3 (2005) página 1-10). Los procedimientos de ensayo de células T actuales incluyen ampliamente incubar muestras proteináceas o peptídicas con una mezcla de APCs y células T previo a la medición de la respuestas de células T, o incubar muestras proteináceas o peptídicas con APCs y después añadir células T previo a la medición de las respuestas de células T. En ambos tipos de ensayo, se utilizan múltiples muestras sanguíneas individualmente para el ensayo paralelo de cada muestra proteinácea o peptídica individual, y las respuestas de células T después se miden habitualmente en un único punto de tiempo. Las respuestas de células T típicamente se miden mediante la incorporación de un pulso de etiqueta radiactiva tal como timidina tritiada (3HTdR) en células T proliferantes ("Proliferación de células T" o mediante la liberación de citoquinas tales como IL-2 de células T activadas ("liberación de citoquinas").

Los procedimientos de ensayo de células T actuales para detectar epítopes de células T son limitados por uno o ambos de sensibilidad pobre y/o interferencia debido a las muestras tóxicas o inmunomoduladoras que inhiben, estimulan o de otra manera modifican las APCs, células T o ambas APCs y células T. Como tal, los procedimientos de ensayo de células T actuales pueden no detectar algunos o todos los epítopes de células T en ciertas muestras proteináceas y peptídicas y pueden no ser aplicables a la medición de las respuestas de células T a muestras tóxicas o inmunomoduladoras incluyendo muestras proteináceas y peptídicas, muestras no proteináceas incluyendo moléculas orgánicas, y formulaciones de muestras no proteináceas y proteináceas donde la misma formulación puede ser inmunomoduladora o tóxica.

En relación a la sensibilidad, una causa primaria de sensibilidad pobre en ensayos de células T ex vivo puede relacionarse con factores en la mezcla de ensayo que reducen las respuestas de células T o antígenos de ensayo incluyendo tipos de células o factores dentro del cultivo de ensayo o por el antígeno de ensayo o las mismas muestras de ensayo. Otras causa de sensibilidad pobre en ensayos de células T ex vivo pueden relacionarse con la cinética de las respuestas de células T a epítopes de células T dentro de las muestras proteináceas o peptídicas por donde los epítopes de células T individuales pueden inducir las respuestas de células T en diferentes tiempos. Para la proliferación de células T donde se utiliza un único punto de tiempo, la proliferación de células T con la adición de ciertas muestras puede, por otro lado ser, inicialmente rápida pero después se reducen en el momento cuando un pulso de etiqueta radioactiva se añade de manera tal que no se detecta ninguna respuesta a la proliferación significativa. Por otro lado, la proliferación de células T con la adición de ciertas otras muestras puede ser inicialmente lenta en el momento cuando un pulso de etiqueta radioactiva se añade de manera tal que no se detecta ninguna respuesta de proliferación significativa aunque la proliferación posterior se vuelva significativa. Para la liberación de citoquina donde se utiliza un único punto de tiempo, la producción de citoquinas con la adición de ciertas muestras, por un lado, puede ser inicialmente rápida pero estas citoquinas pueden ser posteriormente consumidas por las células dentro de la mezcla de ensayo de manera tal que no se detecte ninguna citoquina en el punto de tiempo único de ensayo. Por otro lado, la liberación de citoquinas puede ser inicialmente lenta de manera tal que ninguna respuesta de proliferación es detectada en el punto de tiempo único de ensayo aunque la posterior liberación de citoquinas se vuelva significativa. La cinética de la proliferación o liberación de citoquina puede ser influenciada por un intervalo de factores tales como variación alotípica en respuestas de células T entre diferentes muestras sanguíneas, la eficiencia y cinética de captación y procesamiento por APCs, eficiencia de proteólisis de las muestras proteináceas o peptídicas dentro de APCs, fortaleza y frecuencia de los epítopes de células T dentro de una muestra proteinácea o peptídica, afinidad de unión de los epítopes de células T a alotipos MHC de clase II específicos, eficiencia del reconocimiento de los complejos MHC de clase II peptídicos por los receptores de células T, frecuencia y concentración de moléculas de superficie celular co-estimuladora, concentraciones de citoquinas coestimuladoras, estimulación de otras células en la mezcla de ensayo tales como células T CD8+ o células T supresoras, la presencia de células T de memoria, y la capacidad de algunas muestras tales como péptidos pequeños de cargarse directamente en moléculas MHC de clase II expresadas en la superficie de APCs.

En relación a la interferencia del ensayo de las células T por las muestras tóxicas o inmunomoduladoras, dichas muestras pueden unirse directamente o ser captadas por APCs, células T o ambas APC y células T. Dichas muestras pueden disminuir o incrementar la función inmunológica normal de APCs y/o células T de manera tal que los epítopes de células T o respuestas de células T a las muestras no sea detectados. Otras causa de interferencia de ensayo de células T por las muestras inmunomoduladoras es a través de la toxicidad a APCs, células T o ambas APCs y células T. Otras causas de interferencia de ensayo de células T por muestras inmunomoduladoras incluyen la reducción o incremento de los subconjuntos de APCs o células T tales como el incremento de células T CD8+ o células T supresoras.

A fin de explotar en forma útil los ensayos de células T para un intervalo de aplicaciones especialmente en relación a productos farmacéuticos humanos, existe una necesidad de procedimientos de ensayos de células T más sensibles para la detección óptima de epítopes de células T y también una necesidad de ensayos de células T que puedan utilizarse con muestras tóxicas o inmunomoduladoras.

El documento WO 2004/050706 divulga moléculas CCR5 y FoxP3 que pueden ser moléculas para la depleción o reconocimiento en conformidad con la presente invención. En forma similar, el documento Ep-A-1241249 divulga otras moléculas tales como CTLA-4 y CD4. El documento WO97/39721 divulga... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para medir una respuesta de células T colaboradoras a una sustancia de ensayo que comprende las siguientes etapas:

(a) aislar células que presentan antígenos (APCs) y células T de una muestra obtenida de un organismo;

(b) depletar células T reguladoras de las células aisladas;

(c) incubar dichas APCs y células depletadas de células T reguladoras obtenidas en el punto (b) con la sustancia de ensayo; y

(d) ensayar las respuestas de células T a la sustancia de ensayo.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicho procedimiento además comprende: (ai) separar las células que presentan antígenos (APCs) de otras células; y la etapa (c) comprende incubar la sustancia de ensayo con las APCs separadas previo a la posterior adición de

células depletadas de células T reguladoras.

3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el que las APCs son tratadas con citoquinas previo a la adición de la sustancia de ensayo.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 a 3 en el que las APCs y células T se obtienen de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs).

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que las APCs y células T son humanas.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que las células T reguladoras son depletadas de las células T de CD25hi+.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que las células T son depletadas de células T de CD8+.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que las respuestas de células T son ensayadas mediante la medición de cualquiera o más de la proliferación de células T, liberaciones de citoquinas, Cambios de transcripción de células T, y/u otros marcadores asociados a la activación de células T

9. El procedimiento de la reivindicación 8 en el que la proliferación de células T se mide mediante la captación detimidina tritiada.

10. El procedimiento de la reivindicación 8 en el que la liberación de citoquinas se mide mediante la liberación de IL2 y/o IFNy.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que las respuestas de células T son ensayadas en más que un punto de tiempo durante la incubación.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11 en el que las APCs son incubadas con la sustancia de ensayo durante más de una longitud de tiempo previo a la adición de dichas células depletadas de las células T.

13. El procedimiento de la reivindicación 1-12 en el que la sustancia de ensayo es ensayada en más que una concentración.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que una sustancia de optimización es ensayada para determinar el/los tiempo/s óptimo/s y/o concentración/es para ensayar la sustancia de ensayo.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que la sustancia de ensayo es una proteína.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que la sustancia de ensayo es un péptido

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que la sustancia de ensayo es una no proteína.

18. El procedimiento de la reivindicación 17 en el que la sustancia de ensayo es una molécula orgánica, un lípido, un carbohidrato o una molécula compuesta de dos o más restos incluyendo conjugados, mezclas y formulaciones.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en el que la sustancia de ensayo es inmunomoduladora o tóxica para células T y/o APCs.

20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13 en el que se utilizan PBMCs de dador que expresan alotipos HLA representando >80% de la expresión en la población mundial la población en estudio.

21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13 en el que se utilizan PBMCs de dador para representar los alotipos HLA conectados a una enfermedad en estudio .

22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en el que los péptidos superpuestos de una secuencia proteica son ensayados para identificar epítopes de células T en la secuencia proteica.

23. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 en el que una serie de moléculas son ensayadas individualmente para evaluar la inmunogenicidad relativa.

24. El procedimiento de la reivindicación 23 en el que se utilizan las respuestas relativas de células T como base para seleccionar los productos farmacéuticos principales para el desarrollo adicional.

25. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 en el que una sustancia de ensayo es analizada para evaluar la potencial inmunogenicidad.

26. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 en el que diferentes formulaciones de una sustancia de ensayo son analizadas para evaluar la inmunogenicidad relativa.

27. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 en el que diferentes lotes de fabricación de una sustancia de ensayo son analizados para evaluar la potencial inmunogenicidad.

28. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 en el que una sustancia de ensayo es analizada mediante la utilización de sangre de paciente como una fuente de células T para evaluar la inmunogenicidad a la sustancia de ensayo.

29. El uso de un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para identificar los epítopes de células T en una secuencia proteica.

30. Uso de un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para evaluar la inmunogenicidad de una sustancia de ensayo.