La invención se relaciona, en general, con el empleo de la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA) como adyuvante para potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno en un sujeto.

La invención proporciona una construcción génica que comprende la totalidad o parte de la secuencia codificante de dicha HA fusionada a la secuencia codificante de un antígeno. De aplicación en sanidad humana y animal

Empleo de la hemaglutinina del virus de la peste porcina africana como adyuvante.

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con el empleo de la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA) como adyuvante para potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno en un sujeto. La invención también se relaciona con construcciones génicas que comprenden, completa o parcialmente, la secuencia codificante de dicha hemaglutinina viral fusionada a la secuencia codificante de un antígeno y con sus aplicaciones.

Antecedentes de la invención

Las vacunas constituyen un método exitoso y ampliamente aceptado en la prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas. Son efectivas y no inducen resistencia frente a antibióticos del patógeno diana o afectan a la flora habitual del hospedador. En muchos casos, tales como cuando se induce una inmunidad antiviral, las vacunas pueden prevenir una enfermedad para la que no existe un tratamiento curativo paliativo viable.

Las vacunas funcionan de manera que hacen que el sistema inmune desencadene una respuesta frente a un agente, o antígeno, típicamente un organismo infectivo o una porción del mismo que se introduce en el cuerpo en forma no infecciosa o patogénica. Una vez que se ha sensibilizado al sistema inmune con dicho agente, una exposición posterior en el tiempo a dicho organismo resulta en una respuesta inmune rápida y robusta que destruye al patógeno antes de que éste se pueda multiplicar e infectar suficientes células en el organismo hospedador como para causar síntomas de la enfermedad.

El agente, o antígeno, empleado para desarrollar la respuesta inmune puede ser el microorganismo que provoca la enfermedad en su forma completa en un estado menos infectivo, conocido como microorganismo atenuado, o, en algunos casos, componentes del organismo (en forma de subunidades), tales como hidratos de carbono, proteínas o péptidos que representan varios componentes estructurales del organismo. Asimismo, entre las nuevas tecnologías, merece la pena destacar la inmunización con plásmidos recombinantes de expresión transitoria o vacunas ADN.

Las vacunas ADN se basan en la inmunización con un plásmido que contiene la información genética de uno o varios genes que codifican proteínas inmunogénicas de uno o más patógenos determinados, frente al que (o a los que) se desea inducir una respuesta inmune protectora en el sujeto vacunado. Dicho plásmido actúa como un vector que vehiculiza la introducción de la información genética de interés al interior de las células del hospedador para su expresión, procesamiento y presentación al sistema inmune, en lo que sería una imitación de lo que ocurre durante la infección con el patógeno completo. La respuesta inmune generada, humoral o celular, prepara al sujeto vacunado para contrarrestar una infección con el patógeno, de manera que su utilización de forma profiláctica constituye una potencial herramienta a aplicar, sobre todo en aquellas enfermedades que requieren ambas ramas de la respuesta inmune, tales como las causadas por virus.

Es conocido el empleo de monofosforil lípido A o saponina QS-21 como adyuvantes químicos en vacunación con ADN. Asimismo, se ha descrito el uso de una formulación de liposomas catiónicos (DOTAP) en vacunación con ADN (Etchart et al. J. Gen. Virol. 1997, 78:1577-1580), observándose un efecto adyuvante cuando se administraba por vía oral, pero no cuando se administraba por vía intranasal. El DOTAP también se ha empleado en vacunas ADN que codifican la hemaglutinina del virus de la influenza, sin embargo, su administración inhibe la respuesta inmune.

La utilización de moléculas transportadoras o "carriers" capaces de dirigir específicamente el antígeno vacunal a las células presentadoras de antígeno (CPA), es decir, al "sitio" de inducción de una respuesta inmune en el organismo, presenta varias ventajas respecto a los adyuvantes clásicos utilizados hasta ahora. Por un lado, reducen la toxicidad al activar de una manera muy específica, local y controlada, únicamente a las células que expresan el receptor específico que reconoce el transportador, siendo por otro lado esas CPA las encargadas de presentar el antígeno vacunal al sistema inmune (Lew AM, Brady BJ, Boyle BJ. Site-directed immune responses in DNA vaccines encoding ligand-antigen fusions. Vaccine. 2000 Feb 25; 18(16): 1681-5.). Un buen ejemplo del éxito de este tipo de estrategias proviene de la utilización de la molécula CTLA4 como adyuvante en protocolos de vacunación con ADN, descrito inicialmente a final de los 90's (Boyle JS, Brady JL, Lew AM. Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusión antigen that is directed to sites of immune induction. Nature. 1998 Mar 26; 392(6674):408-11). A pesar de que ha sido demostrada la eficacia de la molécula de CTLA4 para dirigir los antígenos vacunales a las CPA que expresan sus receptores (B7.1 y B7.2), la utilización de este antígeno de superficie de linfocitos T como transportador podría tener efectos secundarios no deseados, tales como el bloqueo inespecífico de la respuesta T. De hecho, la misma molécula que se utiliza en protocolos de vacunación con ADN como adyuvante y transportador de antígenos, se ha propuesto recientemente como inmunosupresor en protocolos de transplante (Li S, Salgar SK, Thanikachalam M, Murdock AD, Gammie JS, Demetris AJ, Zeevi A, Pham SM. CTLA4-Ig-based conditioning regimen to induce tolerance to cardiac allografts. J Surg Res. 2006 Dec; 136(2):238-46. Epub 2006 Oct 13.), o para tratar procesos autoinmunes (Pollard LC. Inhibiting costimulatory activation of T cells: a viable treatment option for rheumatoid arthritis? Drugs. 2007; 67(1): 1-9.).

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de identificar nuevas moléculas transportadoras o "carriers" capaces de dirigir específicamente el antígeno vacunal a las CPA con el fin de potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno en un sujeto.

Compendio de la invención

La invención se relaciona con una nueva estrategia vacunal que permite potenciar tanto la respuesta humoral (anticuerpos) como la respuesta celular inducida tras la vacunación.

Los inventores han encontrado que la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA) potencia la respuesta inmune frente a un antígeno en un sujeto, tanto la respuesta humoral como la respuesta celular inducida tras la vacunación con un antígeno, ejerciendo, por tanto, un efecto adyuvante cuando se utiliza en vacunación con ADN. Dicha HA del VPPA parece tener la capacidad de dirigir un antígeno específicamente a las CPA profesionales (macrófagos y células dendríticas, principalmente), lo que potencia la respuesta inmune frente a un antígeno en un sujeto. Aunque los inventores no desean estar vinculados por ninguna teoría, se cree que la capacidad de dicha HA del VPPA de dirigir antígenos específicamente a las CPA profesionales es debida a que dicha proteína presenta una elevada homología con el antígeno de superficie leucocitario CD2, el cual, como es conocido, tiene receptores en CPA.

En los ensayos realizados por los inventores se han desarrollado unas vacunas ADN fusionando un polinucleótido que codifica un antígeno determinado y un polinucleótido que codifica la fracción soluble de la HA (sHA) del VPPA, y se ha evaluado la respuesta inmune en cerdos inmunizados con dichas vacunas ADN (Ejemplo 1), observándose que, tras la inmunización de cerdos con dichas vacunas ADN, se produce una elevada respuesta inmune frente a dicho antígeno, mucho mayor que la observada en animales control, lo que pone de manifiesto que la respuesta de anticuerpos y la respuesta celular específicamente dirigida contra un antígeno tras la vacunación con ADN se potencia si dicho antígeno se fusiona a dicha HA de VPPA o a una variante funcionalmente equivalente de la misma.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica que comprende (a) un polinucleótido (A) seleccionado entre (i) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA); (ii) un fragmento funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido definido en (i); y (iii) una variante funcionalmente equivalente de dicho polinucleótido definido en (i) que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia codificante de la HA del VPPA; y (b) un polinucleótido (B) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno.

En otro aspecto, la invención se...

1. Una construcción génica que comprende:

2. Construcción génica según la reivindicación 1, en la que el extremo 3' de dicho polinucleótido (A) está unido al extremo 5' de dicho polinucleótido (B).

3. Construcción génica según la reivindicación 1, en la que el extremo 5' de dicho polinucleótido (A) está unido al extremo 3' de dicho polinucleótido (B).

4. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en la que dicho polinucleótido (A) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la fracción soluble de la hemaglutinina (sHA) del virus de la peste porcina africana (VPPA).

5. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho polinucleótido (A) comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 2.

6. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el polinucleótido (B) codifica una proteína de fusión que comprende las proteínas p54 y p30 del VPPA.

7. Construcción génica según la reivindicación 6, en la que el polinucleótido (B) codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3.

8. Construcción génica según la reivindicación 1, 4, 5, 6 ó 7, que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5.

9. Un vector que comprende una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Una proteína de fusión obtenible por expresión de la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de un vector según la reivindicación 9.

11. Una proteína de fusión que comprende:

12. Proteína según la reivindicación 11, en la que el extremo carboxilo de dicho polipéptido (A) está unido al extremo amino de dicho polipéptido (B).

13. Proteína según la reivindicación 11, en la que el extremo amino de dicho polipéptido (A') está unido al extremo carboxilo de dicho polipéptido (B').

14. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que dicho polipéptido (A') comprende la fracción soluble de la hemaglutinina (sHA) del virus de la peste porcina africana (VPPA).

15. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la que dicho polipéptido (A') comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2.

16. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en la que el polipéptido (B') es una proteína de fusión que comprende las proteínas p54 y p30 del VPPA.

17. Proteína según la reivindicación 16, en la que dicha proteína tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4.

18. Una célula hospedadora que contiene una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un vector según la reivindicación 9, o una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17.

19. Una célula hospedadora según la reivindicación 18, en la que dicha célula es una célula presentadora de antígenos (CPA).

20. Método para producir una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, que comprende introducir en una célula hospedadora una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un vector según la reivindicación 9, y recuperar la proteína de fusión del medio de cultivo o del interior de la célula hospedadora.

21. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de un vector según la reivindicación 9, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, o de una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Uso de una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de un vector según la reivindicación 9, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, o de una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de una enfermedad causada por un organismo que expresa o contiene dicho antígeno.

23. Uso de la hemaglutinina (HA) del virus de la peste porcina africana (VPPA), o de un fragmento funcionalmente equivalente de la misma, o de una variante funcionalmente equivalente de la misma que muestra una identidad mínima del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la HA del VPPA, como adyuvante en la elaboración de una composición farmacéutica.

24. Uso según la reivindicación 23, en donde la composición farmacéutica es utilizada para potenciar la respuesta inmune frente a un antígeno administrado conjuntamente con dicha composición potenciadora de la respuesta inmune.

25. Un anticuerpo con capacidad para unirse a una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17.

26. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la reivindicación 25.

27. Uso de un anticuerpo según la reivindicación 25, en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por un organismo que contiene el antígeno presente en dicha proteína de fusión.

28. Una célula del sistema inmune, aislada, con capacidad para reconocer a una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17.

29. Una composición farmacéutica que comprende una célula del sistema inmune según la reivindicación 28.

30. Uso de una célula del sistema inmune según la reivindicación 28, en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por un organismo que contiene el antígeno presente en dicha proteína de fusión.