ELECTROFÓRESIS CON MARCADOR DE ADN BICATENARIO.

Un procedimiento para la separación de una diana de medición por electroforesis que comprende usar una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria marcada con un marcador,

en el que dicha sustancia que tiene afinidad por dicha diana de medición tiene una propiedad de unión por la diana de medición basada en la interacción entre "antígeno" y "anticuerpo", "cadena de azúcar" y "lectina", "enzima" e "inhibidor", "proteína" y "cadena peptídica" o "receptor" y "ligando"

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2002/003336.

Solicitante: WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 1-2, DOSHOMACHI 3-CHOME, CHUO-KU OSAKA-SHI, OSAKA 540-8605 JAPON.

Inventor/es: NAKAMURA, KENJI, KAWABATA, TOMOHISA, SATOMURA, SHINJI.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 3 de Abril de 2002.

Fecha Concesión Europea: 5 de Mayo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/532 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Producción de compuestos inmunoquímicos marcados.

Clasificación PCT:

  • G01N27/26 G01N […] › G01N 27/00 Investigación o análisis de materiales mediante el empleo de medios eléctricos, electroquímicos o magnéticos (G01N 3/00 - G01N 25/00 tienen prioridad; medida o ensayo de variables eléctricas o magnéticas o de las propiedades eléctricas o magnéticas de los materiales G01R). › investigando variables electroquímicas; utilizando la electrólisis o la electroforesis.
  • G01N27/447 G01N 27/00 […] › utilizando la electroforesis.
  • G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G01N33/532 G01N 33/00 […] › Producción de compuestos inmunoquímicos marcados.
  • G01N33/537 G01N 33/00 […] › con separación del complejo inmunológico del antígeno o del anticuerpo no ligados.
  • G01N33/558 G01N 33/00 […] › utilizando la difusión o la migración del anticuerpo o del antígeno.
  • G01N33/561 G01N 33/00 […] › Inmunoelectroforesis.

Clasificación antigua:

  • G01N27/447 G01N 27/00 […] › utilizando la electroforesis.
  • G01N33/532 G01N 33/00 […] › Producción de compuestos inmunoquímicos marcados.
  • G01N33/537 G01N 33/00 […] › con separación del complejo inmunológico del antígeno o del anticuerpo no ligados.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.


Fragmento de la descripción:

Campo Técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para separar sustancias utilizando electroforesis y un procedimiento para medir la diana de medición separada por dicho procedimiento de separación. Técnica Antecedente

En un Microsistema de Análisis Total (µ-TAS; Laboratorio en una microplaca) que se supone que es un medio de análisis de nueva generación, una serie de análisis químicos y bioquímicos tales como extracción de un componente diana para su análisis de una muestra biológica (etapa de extracción), análisis del componente usando una reacción química/bioquímica (etapa analítica), así como un procesamiento posterior para su separación (etapa de separación) y detección (etapa de detección), se realizan todos en un analizador extremadamente pequeño integrado en una microplaca, de varios cm a varias decenas de cm en un lado. Como procedimientos de separación para este sistema, se han reconocido ampliamente los procedimientos siguientes. La electroforesis capilar utiliza una diferencia de la carga de sustancias en un alto campo eléctrico, en el que se prepara un capilar (tubo fino), de 1 mm o menos de diámetro interior, con un compuesto polimérico, teflón o sílice como material fácilmente aplicable sobre un sustrato para un procesamiento fino. La cromatografía en columna capilar utiliza una diferencia de interacción entre un soporte de columna y una sustancia usando un capilar similar.

Entre ellos, la electroforesis capilar tiene características que, puesto que el área de superficie capilar es considerablemente grande respecto al volumen interior del capilar, la generación de calor de Joule por aplicación de alto voltaje se bloquea eficazmente y proporciona mayor resolución en un periodo de tiempo corto que la electroforesis convencional. Por lo tanto, la electroforesis capilar se ha considerado como un procedimiento adecuado para µ-TAS puesto que se permite la separación en una longitud de separación relativamente corta.

Particularmente, en los últimos años, se ha desarrollado una técnica de separación, la denominada electroforesis en microplaca capilar, como uno de los procedimientos electroforéticos capilares para µ-TAS, en la que se genera un capilar en una microplaca de varios cm a varias decenas de cm en un lado por medio de una técnica de procesamiento fina tal como fotolitografía [J. Chromatogr. (1992) 593, 253-258, Manz, A. y col., Anal. Chem. (1992) 64, 1926-1932, Harrison, D. J. y col.; Anal. Chem. (1994) 66, 3472-3476, Jacobson, S. C. y col., Science (1993) 261, 895-897, Harrison, D. J. y col., Anal. Chem. (1993) 65, 2637-2642, Effenhauser, C. S. y col.].

En el procedimiento electroforético en microplaca capilar mencionado anteriormente, sin

embargo, existe una limitación en la longitud del capilar para la separación y la longitud para la separación se acorta mucho en comparación con la de la electroforesis capilar convencional. Por lo tanto, se vuelve un problema que la capacidad de separación sea insuficiente para moléculas relativamente grandes tales como ácidos nucleicos, polipéptidos y proteínas, aunque es suficiente para sustancias de bajo peso molecular enormemente influenciadas por una carga eléctrica intramolecular.

Para resolver esta cuestión, se ha desarrollado un procedimiento de separación usando un polímero que tiene un efecto de tamiz molecular, por ejemplo, hidroxietilcelulosa y poliacrilamida como aditivo añadido en el capilar [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 1134811352, Woolly, A. T. y Mathies, R. A., Anal. Chem. (1996) 68, 720-723, Jacobson, S. C. y Ramsey, J. M., Anal. Chem. (1997) 69, 2181-2186, Woolley, A. T., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 11348-11352, Woolley, A. T. y Mathies, R. A.; Anal. Chem. (1994) 66, 29492953, Effenhauser, C.S., y col.; Anal. Chem (1995) 67, 3676-3680] y etcétera]. En las circunstancias actuales, sin embargo, la separación de polipéptidos o proteínas es todavía insuficiente incluso de acuerdo con estos procedimientos.

También se propone como otro procedimiento para separar proteínas el uso de un polímero de acrilamida que tenga un efecto de tamiz molecular como agente de envasado de capilar en presencia de dodecilsulfato sódico [SDS-PAGE: Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 5372-5377, Yao, S., y col.]. En este procedimiento, sin embargo, puesto que las proteínas tienen que desnaturalizarse con dodecilsulfato sódico, es difícil separarlas al tiempo que mantengan sus propias actividades tales como la actividad de unión específica.

Para resolver estos problemas se ha descrito el procedimiento siguiente (Patente Japonesa Nº 3.070.418; WO 98/512371). Se permite que un componente diana para análisis reaccione con 2 especies de sustancias, teniendo una de ellas una afinidad específica hacia la diana y uniéndose a una sustancia cargada, y teniendo otra una afinidad específica hacia la diana y uniéndose a un marcador detectable, para formar un complejo que comprende estos 3 componentes (sustancia que tiene una afinidad específica hacia la diana y se une a una sustancia cargada-componente diana para análisis-sustancia que tiene una afinidad específica hacia la diana y se une a un marcador detectable). El complejo se separa de la sustancia que tiene una afinidad específica hacia la diana y se une a un marcador detectable no implicado en la formación del complejo mediante un procedimiento de separación eléctrico (B/F) que utiliza la diferencia de carga entre la sustancia cargada contenida en el complejo y la sustancia que tiene una afinidad específica hacia la diana y que se une a un marcador detectable no implicada en la formación del complejo.

En este procedimiento, sin embargo, es necesario que la sustancia cargada que mejora

la capacidad de separación y el marcador para su detección hayan estado cada uno siempre unidos a un tipo diferente de sustancia que tiene una afinidad específica hacia la diana. Como desventaja adicional, también es necesario ajustar la cantidad del marcador detectable que se une a una sustancia capaz de unirse específicamente al componente diana, puesto que la carga de la sustancia capaz de unirse específicamente al componente diana y de unirse al marcador detectable se modifica para disminuir la precisión de separación y ensanchar el pico de separación.

Además, se conocen procedimientos de inmunoensayo basados en separación electroforética (capilar) de los documentos US 5.570.680, US 6.103.537, EP-A-0815942, EP-A0755941 y US 5.137.609; se conocen procedimientos de inmunoensayo basados en HPLC de los documentos EP-A-0357869 y EP-A-1061370; y se conocen procedimientos de inmunoensayo basados en exclusión en gel o cromatografía de afinidad del documento US

5.981.171.

En vista del estado de la técnica mencionado anteriormente, la invención pretende proporcionar un procedimiento para separar una diana de medición utilizando electroforesis de forma eficaz con gran sensibilidad y en un periodo de tiempo corto, y un procedimiento para medir la diana de medición separada por el procedimiento de separación. Divulgación de la Invención

La invención se realizó para resolver los problemas mencionados anteriormente y está relacionada con lo siguiente:

(1) Un procedimiento para la separación de una diana de medición por electroforesis que comprende usar una sustancia a la que está unida una cadena de ácido nucleico bicatenaria marcada con un marcador, en el que dicha sustancia que tiene una afinidad por dicha diana de medición tiene una propiedad de unión por la diana de medición basada en la interacción entre “antígeno” y “anticuerpo”, “cadena de azúcar” y “lectina”, “enzima” e “inhibidor”, “proteína” y “cadena peptídica” o “receptor” y “ligando”.

(2) Dicho procedimiento de separación por electroforesis que comprende formar un complejo que comprende la diana de medición-(la cadena de ácido nucleico-sustancia con afinidad de unión-marcador) a partir de una muestra que contiene una diana de medición, una sustancia a la que está unida una cadena de ácido nucleico y que tiene una afinidad hacia la diana de medición (en lo sucesivo abreviada a veces como cadena de ácido nucleico-sustancia con afinidad de unión) y un marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico y separar dicho complejo de la cadena de ácido nucleico-sustancia con afinidad de unión-marcador no implicada en la formación de dicho complejo y, si es necesario, del marcador por electroforesis....

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para la separación de una diana de medición por electroforesis que comprende usar una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria marcada con un marcador, en el que dicha sustancia que tiene afinidad por dicha diana de medición tiene una propiedad de unión por la diana de medición basada en la interacción entre “antígeno” y “anticuerpo”, “cadena de azúcar” y “lectina”, “enzima” e “inhibidor”, “proteína” y “cadena peptídica” o “receptor” y “ligando”.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende: formar un complejo 1 que comprende la a) diana de medición, b) una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia la diana de medición (la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión) y c) un marcador de una muestra que contiene una diana de medición, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión y un marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria y separar dicho complejo 1 de un complejo 2 de la cadena de ácido nucleico bicatenariasustancia con afinidad de unión y el marcador no implicado en la formación de dicho complejo 1 y, si es necesario, del marcador por electroforesis.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende: poner mutuamente en contacto a) una muestra que contiene una diana de medición, b) una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia la diana de medición (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión) y c) un marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria y separar el complejo 1 resultante que comprende la diana de medición, la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión y el marcador de un complejo 2 de la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión y el marcador no implicado en la formación de dicho complejo 1 y, si es necesario, del marcador por electroforesis.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la muestra que contiene la diana de medición, la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia la diana de medición (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión) y el marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria se ponen

en contacto todos al mismo tiempo.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el marcador capaz de marcar una cadena de ácido nucleico bicatenaria se pone en contacto con la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión y después el producto se pone en contacto con la diana de medición.

6. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión se pone en contacto con la diana de medición y después el producto se pone en contacto con el marcador capaz de marcar una cadena de ácido nucleico bicatenaria.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende: formar un complejo 1 que comprende a) una diana de medición, b) dos o más especies de sustancias a las que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tienen afinidad hacia la diana de medición y sitios de unión mutuamente diferentes para la diana de medición (dos o más especies de la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión) y c) un marcador de una muestra que contiene una diana de medición, dos o más especies de la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión y un marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria y separar dicho complejo 1 de un complejo 2 de la cadena de ácido nucleico bicatenariasustancia con afinidad de unión y el marcador no implicado en la formación de dicho complejo 1 y, si es necesario, del marcador por electroforesis.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende: poner mutuamente en contacto a) una muestra que contiene una diana de medición, b) dos

o más especies de sustancias a las que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tienen afinidad hacia la diana de medición y sitios de unión mutuamente diferentes para la diana de medición (dos o más especies de la cadena de ácido nucleico bicatenariasustancia con afinidad de unión) y c) un marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria y separar el complejo 1 resultante que comprende la diana de medición, las dos o más especies de la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión y el marcador de un complejo 2 de la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión y el marcador no implicado en la formación de dicho complejo 1 y, si es necesario, del marcador por electroforesis.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la muestra que contiene la diana de medición y dos o más especies de sustancias a las que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tienen afinidad hacia la diana de medición y sitios de unión mutuamente diferentes para la diana de medición se ponen en contacto todos al mismo tiempo.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria se pone en contacto con dos o más especies de sustancias a las que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tienen afinidad hacia la diana de medición y sitios de unión mutuamente diferentes para la diana de medición y después el producto se pone en contacto con la diana de medición.

11. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dos o más especies de sustancias a las que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tienen afinidad hacia la diana de medición y sitios de unión mutuamente diferentes para la diana de medición se ponen en contacto con la diana de medición, y después el producto se pone en contacto con el marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende: formar [1] un complejo de una diana de medición A1, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An y un marcador, [2] un complejo de una diana de medición A2, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An y un marcador, [3] un complejo de una diana de medición A3, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA3:An, y un marcador, ..., [n-1] un complejo de una diana de medición An-1 , una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA3:An, ..., una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BAn-1:An y un marcador, y [n] un complejo de una diana de medición An una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA3:An, ... una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BAn-1:An, una cadena de ácido nucleico

bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BAn y un marcador de (a) una muestra que contiene n tipos mutuamente diferentes de diana de medición A1, A2, A3, ... An-1 y An para su medición, (b) (1) una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria que tiene afinidad hacia todos los tipos de la diana de medición A1 a An (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An), (2) una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico y que tiene afinidad hacia todos los tipos de la diana de medición A2 a An excepto por A1 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An), (3) una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todos los tipos de la diana de medición A3 a An excepto por A1 y A2 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA3:An), ..., (n-1) una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia la diana de medición An-1 y An excepto por todas de A1 a An-2 (cadena de ácido nucleico-sustancia con afinidad de unión Bn-1:An), y (n) una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad sólo hacia la diana de medición An, excepto por todas de A1 a An-1 (cadena de ácido nucleico bicatenariasustancia con afinidad de unión BAn), y (c) un marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria y, después, separar los complejos respectivos [1] a [n] de complejos de la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancias con afinidad de unión (1) a (n) respectivos y los marcadores no implicados en la formación de dichos complejos [1] a [n] y, si es necesario, de los marcadores por electroforesis.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que n es de 2 a 10.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende: poner mutuamente en contacto (a) una muestra que contiene n tipos mutuamente diferentes de diana de medición A1, A2, A3, ... An-1 y An, (b)(1) una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todas las dianas de medición A1 a An (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An), (2) una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todos los tipos de la diana de medición A2 a An excepto por A1 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An), (3) una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todos los tipos de la diana de medición A3 a An excepto por A1 y A2 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA3:An), ..., (n-1) una sustancia a la que se une

una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia las dianas de medición An-1 y An excepto por todas de A1 a An-2 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión Bn-1:An), y (n) una sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad sólo hacia la diana de medición An excepto por todas de A1 a An-1 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BAn), y (c) un marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria y separar el resultante [1] complejo de diana de medición A1, cadena de ácido nucleico bicatenariasustancia con afinidad de unión BA1:An y marcador resultante, [2] complejo de la diana de medición A2, la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An, la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An y el marcador, [3] complejo de la diana de medición A3, la cadena de ácido nucleico bicatenariasustancia con afinidad de unión BA1:An, la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An, la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA3:An, y el marcador, ..., [n-1] complejo de la diana de medición An-1 , la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An, la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An, la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA3:An, ..., la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BAn-1:An y el marcador, y [n] un complejo de la diana de medición An la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An, la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An, la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA3:An, ... la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BAn-1:An, la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BAn y el marcador de complejos de las cadenas de ácido nucleico bicatenarias-sustancias con afinidad de unión (1) a (n) respectivos y los marcadores no implicados en la formación de dichos complejos [1] a [n] y, si es necesario, de los marcadores por electroforesis.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que (a) la muestra que contiene n tipos mutuamente diferentes de diana de medición A1, A2, A3, ... An-1 y An (b)(1) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todos los tipos de dianas de medición A1 a An (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An), (2) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todos los tipos de diana de medición A2 a An excepto por A1 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An), (3) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todos los tipos de diana

de medición A3 a An excepto por A1 y A2 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA3:An), ..., (n-1) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia las dianas de medición An-1 y An excepto por todas de A1 a An-2 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión Bn-1:An), y (n) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad sólo hacia la diana de medición An excepto por todas de A1 a An-1 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BAn), y (c) el marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria, se ponen todos en contacto al mismo tiempo.

16. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que (b)(1) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todos los tipos de la diana de medición A1 a An (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA1:An), (2) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todos los tipos de diana de medición A2 a An excepto por A1 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An), (3) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todos los tipos de diana de medición A3 a An excepto por A1 y A2 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA3:An), ..., (n-1) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia las dianas de medición An-1 y An excepto por todas de A1 a An-2 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión Bn-1:An), y (n) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad sólo hacia la diana de medición An excepto por todas de A1 a An-1 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BAn), se pone en contacto con (c) el marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria y, después, el producto se pone en contacto con (a) la muestra que contiene n tipos mutuamente diferentes de diana de medición A1, A2, A3, ... An-1 y An.

17. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que (a) la muestra que contiene n tipos mutuamente diferentes de diana de medición A1, A2, A3, ... An-1 y An se pone en contacto con (b)(1) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todos los tipos de diana de medición A1 a An (cadena de ácido nucleico bicatenariasustancia con afinidad de unión BA1:An), (2) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia todos los tipos de diana de medición A2 a An excepto por A1 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA2:An), (3) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia

todos los tipos de diana de medición A3 a An excepto por A1 y A2 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BA3:An), ..., (n-1) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad hacia las dianas de medición An-1 y An excepto por todas de A1 a An-2 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión Bn-1:An), y (n) la sustancia a la que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tiene afinidad sólo hacia la diana de medición An excepto por todas de A1 a An-1 (cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión BAn), y después, el producto se pone en contacto con (c) el marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria .

18. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende: formar 2 o más especies de complejo 1 que comprende a) un tipo específico de diana de medición, b) una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia de unión que tiene afinidad sólo por dicho tipo específico de diana de medición y c) el marcador de una muestra que contiene 2 o más tipos de diana de medición, 2 o más especies de sustancias a las que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tienen afinidad sólo por uno de los tipos de diana de medición deseados (cadenas de ácido nucleico bicatenarias-sustancias con afinidad de unión específicas) y un marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria y, después, separar dicho complejo 1 de un complejo 2 de la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión específica y el marcador no implicado en la formación de dicho complejo 1 y, si es necesario, del marcador, respectivamente, por electroforesis.

19. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende: poner mutuamente en contacto (a) una muestra que contiene 2 o más tipos de diana de medición, b) 2 o mas especies de sustancias a las que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tienen afinidad sólo hacia un tipo cualquiera de los tipos de diana de medición deseados (cadenas de ácido nucleico bicatenarias-sustancias con afinidad de unión específicas) y c) un marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria y separar las resultantes 2 o más especies de complejo 1 que comprende un tipo específico de diana de medición, una cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia de unión que tienen afinidad sólo por dicha diana de medición específica y un marcador, de un complejo 2 de la cadena de ácido nucleico bicatenaria-sustancia con afinidad de unión específica y el marcador no implicado en la formación de dicho complejo 1 y, si es necesario, del marcador, respectivamente, por electroforesis.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que la muestra que contiene 2 o más tipos de diana de medición, 2 o más especies de sustancias a las que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tienen afinidad sólo por un tipo cualquiera de los tipos de diana de medición deseados y el marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria ponen en contacto todos al mismo tiempo.

21. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que 2 o más especies de sustancias a las que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tienen afinidad sólo por un tipo cualquiera de los tipos de diana de medición se ponen en contacto con el marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria y después el producto se pone en contacto con la muestra que contiene 2 o más tipos de diana de medición.

22. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que la muestra que contiene 2 o más tipos de diana de medición se pone en contacto con 2 o más especies de sustancias a las que se une una cadena de ácido nucleico bicatenaria y que tienen afinidad sólo por un tipo cualquiera de los tipos deseados de diana de medición y, después, el producto se pone en contacto con el marcador capaz de marcar dicha cadena de ácido nucleico bicatenaria.

23. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en el que cada uno de los 2 o más tipos de diana de medición tienen un número diferente de sitios capaces de unirse a una sustancia que tiene afinidad sólo por la misma .

24. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en el que el ácido nucleico bicatenario que se une a cada una de 2 o más especies de las sustancias que tienen afinidad sólo por un tipo cualquiera de los tipos de diana de medición es de un tamaño diferente.

25. El procedimiento de la reivindicación 1, que es adecuado para la medición de 1 o más tipos de diana de medición a una muestra y que comprende medir el complejo o complejos separados por el procedimiento que se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a

24.

26. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que la electroforesis es electroforesis capilar.


 

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