DISPOSITIVO OLIGOCROMÁTICO DE UN PASO Y PROCEDIMIENTO DE USO.

Un dispositivo cromatrográfico (1) en forma de lámina que está fabricado de laminados de nitrocelulosa de doble cara que comprende:

- una región (2) de aplicación opcionalmente con una almohadilla de conjugado, - una región (3) de detección posiblemente con una región de control, - opcionalmente una región (4) adsorbente y - un lado (11) de prueba y un lado (12) de control, en el que dicho lado (11) de prueba contiene reactivos para la detección específica de la secuencia de polinucleótidos diana de interés (7) y en el que dicho lado (12) de control contiene medios cromatográficos de control fabricados de un conjugado (14) de sonda de control para la detección específica de una secuencia (13) de oligonucleótidos de control, en el que dicha región (3) de detección comprende al menos un reactivo (5) de captura que reconoce específicamente un hapteno o péptido (8) conjugado con un oligonucleótido específico para el analito, en el que la región (2) de aplicación comprende al menos - un conjugado de sonda etiquetada (6) específica para dicho polinucleótido (7) o un producto amplificado obtenido a partir de la amplificación molecular del analito, estando dicho conjugado de sonda etiquetada (6) impregnado sobre el lado de prueba y que permite la detección de dicho polinucleótido o producto etiquetado generando una señal específica, y - un conjugado de sonda etiquetada (14) específica para dicha secuencia (13) de oligonucleótidos de control o un producto amplificado de una amplificación molecular, estando dicho conjugado de sonda (14) etiquetada impregnado sobre el lado de control y que permite la detección de dicha secuencia de oligonucleótidos de control o del producto amplificado generando una señal específica

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/BE2004/000061.

Solicitante: CORIS BIOCONCEPT SPRL.

Nacionalidad solicitante: Bélgica.

Dirección: RUE JEAN SONET, 4A 5032 GEMBLOUX BELGICA.

Inventor/es: MERTENS,Pascal, RENUART,Ismaelle, LECLIPTEUX,Thierry.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 30 de Abril de 2004.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68B10
  • G01N33/543K4
  • G01N33/558 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › utilizando la difusión o la migración del anticuerpo o del antígeno.

Clasificación PCT:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/558 G01N 33/00 […] › utilizando la difusión o la migración del anticuerpo o del antígeno.

Clasificación antigua:

  • C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/558 G01N 33/00 […] › utilizando la difusión o la migración del anticuerpo o del antígeno.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre.

PDF original: ES-2363501_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y dispositivos para detectar analitos en muestras biológicas. Esta invención se refiere a ensayos rápidos y a ensayos rápidos típicos que incluyen “tiras reactivas”, dispositivos de “flujo lateral” y dispositivos de “flujo a través”

Estado de la técnica

Se han desarrollado algunas aproximaciones para la detección de analitos en una muestra biológica para diagnósticos rutinarios en laboratorios a través de la inmunocromatografía.

Los documentos EP 0 088 636, EP 0 186 799, EP 0 284 232 y WO 88/08534, WO 03/033765 divulgan dispositivos cromatográficos en forma de lámina que comprenden al menos una primera y una segunda región. Los dispositivos de la técnica anterior presentados en estos documentos comprenden:

- una primera región que contiene material activo poroso para permitir que el líquido se mueva hacia la región sintetizada recubierta con los reactivos específicos. Esta primera región, denominada almohadilla de muestras, comprende sobre ella un reactivo de detección secado o impregnado dentro de ella. Además puede contener una región de aplicación y una (sub)región de absorción. La región de la almohadilla de muestras se denomina generalmente región de aplicación.

- una segunda región, también denominada región de detección, hecha de material poroso activo sobre el cual se absorben reactivos específicos. Algunos de estos reactivos pulverizados sobre una línea de la segunda región del dispositivo son directa o indirectamente específicos para el analito a detectar y deben reaccionar con el complejo de reactivos etiquetados para el analito de la muestra mientras otros reactivos no específicos eventualmente pulverizados sobre una línea adicional de la segunda región están dedicados a reaccionar con el exceso del reactivo de detección. Esta segunda región, hecha preferiblemente de nitrocelulosa, también puede contener una línea de control, preferiblemente detrás de la región de detección; y

- posiblemente también una tercera región hecha de material poroso dedicada a absorber el exceso de líquido que llega a través de las primera y segunda regiones. Esta región se denomina generalmente absorbente o región absorbente.

Algunas otras técnicas de detección conocidas en la técnica se refieren a la detección de moléculas producidas después de un proceso preliminar tal como una amplificación molecular o genética del analito.

La patente US 6.037.127 describe un procedimiento para detectar la presencia de un analito de ácido nucleico no desnaturalizado en una muestra de ensayo en el que la muestra de ensayo se pone en contacto con una tira de ensayo de un material poroso muy absorbente que es capaz de mover la muestra de ensayo lateralmente a lo largo de la tira de ensayo mediante migración capilar hasta su captura final por una molécula en una zona de captura específica.

Objetivos de la invención

La presente invención se dirige a suministrar una nueva e ingeniosa técnica de captura para la detección de moléculas de polinucleótidos posiblemente obtenidas después de pasos de amplificación molecular.

Un objetivo adicional de la invención es suministrar dispositivos que sean fáciles de manejar y que permitan una detección y/o una diagnosis rápida y exacta.

Definiciones

Iniciador: Oligonucleótido específico para el analito (usado para la amplificación, etiquetado para reaccionar con el reactivo de captura)

Conjugado: Sonda específica para el analito acoplada con una etiqueta en partículas directa.

Reactivo de captura: Reactivo que reaccionará específicamente con el oligonucleótido específico para el analito etiquetado.

Almohadilla absorbente: Primera región o almohadilla de muestras Almohadilla de conjugado: Región que contiene el conjugado seco.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un dispositivo cromatográfico en forma de lámina, en particular tiras reactivas, dispositivos de flujo a través y de flujo lateral, que tienen

- una región de aplicación (opcionalmente con almohadilla de conjugación),

- una región de detección (posiblemente con una parte de control (por ejemplo, líneas de control) y

- opcionalmente una región absorbente. La región de detección comprende al menos un reactivo de captura que reconoce específicamente un hapteno o péptido conjugado o acoplado con el oligonucleótido específico para el analito, y la región de aplicación comprende al menos un conjugado de sonda específica etiquetada (con etiqueta directa o indirecta) preferiblemente un oligonucleótido (ADN, ARN, APN, ALN) que se hibrida específicamente con el analito y que generalmente se denomina sonda. En caso de reacción positiva, es decir en el caso de que se forme un complejo entre dicho reactivo (de captura) específico y dicho analito específico acoplado en un hapteno o un péptido hibridizado con dicho conjugado específico, se genera una señal. Esta señal también se denomina señal específica. El oligonucleótido específico para el analito es uno de los iniciadores usados para la amplificación molecular del analito (S).

En una realización particular de la invención, la línea de control está hecha de una secuencia de oligonucleótidos que se hibrida con la sonda de conjugado específico.

El reactivo de captura puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal o un fragmento de anticuerpo hipervariable o una molécula que interactúa específicamente con el hapteno o el péptido o con cualquier conjugado de moléculas o se acopla con el oligonucleótido específico para el analito. La etiqueta de detección es preferiblemente un etiqueta en partículas directa, preferiblemente seleccionada entre el grupo que consta de coloides metálicos conjugados, partículas de látex conjugadas y micropartículas que tengan un color particular.

Preferiblemente el dispositivo cromatográfico en forma de lámina está compuesto de sustancias poliméricas laminadas sobre un polímero rígido. En una realización preferida, la región de aplicación comprende una membrana hecha de fibras de vidrio con una almohadilla de conjugado hecha de poliéster, la región de detección comprende una membrana hecha de nitrocelulosa y la región absorbente comprende una membrana hecha de celulosa. De acuerdo con otra realización, la región de aplicación y la almohadilla de conjugado están hechas del mismo material.

La presente invención se refiere además a procedimientos de detección que hacen uso de los dispositivos antes descritos, también denominados dispositivos oligocromatogáficos, que pueden usarse para comprobar la presencia de secuencias de oligonucleótidos diana preferiblemente después de su amplificación. La detección puede realizarse a simple vista y/o automáticamente con la ayuda de un lector de tiras y programas de software específicos para la detección y/o cuantificación de analitos o amplicones.

La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos y realizaciones no limitativas, con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de la invención

La figura 1 representa un ensayo positivo obtenido con el dispositivo de detección de la invención.

Las figuras 2a y 2b representan los diferentes pasos de detección de procedimiento de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere en particular a dispositivos (1) de detección de analitos mejorados tanto dispositivos cromatográficos tales como dispositivos de tiras reactivas o de flujo lateral como sistemas de flujo a través y a su uso en la detección de analitos posiblemente presentes en una muestra tal como una muestra de líquido transparente. Los dispositivos preferidos comprenden una región (2) de aplicación, una región (3) de detección y posiblemente una región

(4) de adsorción tal como se conoce en la técnica. La región de detección (3) puede contener una o más partes definidas, preferiblemente líneas, cada una de ellas dedicadas a la detección de un analito o grupo de analitos en particular. Puede incluirse una región de control, que posiblemente contiene varias partes (líneas). Los dispositivos de la... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un dispositivo cromatrográfico (1) en forma de lámina que está fabricado de laminados de nitrocelulosa de doble cara que comprende:

- una región (2) de aplicación opcionalmente con una almohadilla de conjugado,

- una región (3) de detección posiblemente con una región de control,

- opcionalmente una región (4) adsorbente y

- un lado (11) de prueba y un lado (12) de control, en el que dicho lado (11) de prueba contiene reactivos para la detección específica de la secuencia de polinucleótidos diana de interés (7) y en el que dicho lado (12) de control contiene medios cromatográficos de control fabricados de un conjugado (14) de sonda de control para la detección específica de una secuencia (13) de oligonucleótidos de control, en el que dicha región (3) de detección comprende al menos un reactivo (5) de captura que reconoce específicamente un hapteno o péptido (8) conjugado con un oligonucleótido específico para el analito, en el que la región (2) de aplicación comprende al menos

- un conjugado de sonda etiquetada (6) específica para dicho polinucleótido (7) o un producto amplificado obtenido a partir de la amplificación molecular del analito, estando dicho conjugado de sonda etiquetada (6) impregnado sobre el lado de prueba y que permite la detección de dicho polinucleótido o producto etiquetado generando una señal específica, y

- un conjugado de sonda etiquetada (14) específica para dicha secuencia (13) de oligonucleótidos de control o un producto amplificado de una amplificación molecular, estando dicho conjugado de sonda (14) etiquetada impregnado sobre el lado de control y que permite la detección de dicha secuencia de oligonucleótidos de control o del producto amplificado generando una señal específica.

2. El dispositivo cromatográfico en forma de lámina de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho oligonucleótido específico para el analito es idéntico al de los iniciadores usados para la amplificación molecular del analito.

3. El dispositivo cromatográfico en forma de lámina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el reactivo (5) es un anticuerpo policlonal o monoclonal o un fragmento de anticuerpo hipervariable o cualquier otra molécula capaz de unirse al hapteno o al péptido (8).

4. El dispositivo cromatográfico en forma de lámina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los conjugados (6, 14) de sonda etiquetada específica son secuencias de oligonucleótidos conjugados con una etiqueta directa (15) y específicos para la secuencia de oligonucleótidos diana de interés (7) o para la secuencia (13) de oligonucleótidos de control.

5. El dispositivo cromatográfico en forma de lámina de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la etiqueta (15) se selecciona entre el grupo que consiste en coloides metálicos conjugados, partículas de látex conjugadas y micropartículas que tienen un color específico particular.

6. El dispositivo cromatográfico en forma de lámina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que se selecciona entre el grupo que consiste en una tira reactiva o un dispositivo de flujo lateral.

7. El dispositivo cromatográfico en forma de lámina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está compuesto de substancias poliméricas laminadas sobre un soporte sólido rígido (17), preferiblemente un soporte de polímero en el que dicho lado (12) de control contiene elementos (16) de control de la migración.

8. El dispositivo cromatográfico en forma de lámina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la región (2) de aplicación comprende una membrana fabricada de fibras de vidrio con una almohadilla de conjugado de poliéster, en el que la región (3) de detección comprende una membrana fabricada de nitrocelulosa, nylon o una membrana de poliéter sulfona (predator) sin limitación y en el que la región adsorbente (4) comprende una membrana hecha de celulosa.

9. El dispositivo cromatográfico en forma de lámina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la región (2) de aplicación y la almohadilla de conjugado están fabricadas del mismo material.

10. Un procedimiento para detectar y/o cuantificar al menos un analito en una muestra biológica detectando la presencia o ausencia de una secuencia (7) de polinucleótidos diana a partir de una amplificación molecular de dicho analito, en el que la secuencia (7) de polinucleótidos se pone en contacto con el dispositivo cromatográfico (1) en forma de lámina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 11.

 

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