DETECCIÓN DE NEISSERIA GONORRHOEAE UTILIZANDO LA REGIÓN 5' NO TRADUCIDA DEL GEN OPA.

Oligonucleotido especifico de Neisseria gonorrhoeae, que comprende una secuencia de nucleotidos que comprende la secuencia 5'-TTTGAACC-3',

o su complemento, capaz de hibridizar con la region 5' no traducida de un gen opa de NG o su complemento, en el que dicho oligonucleotido es de 12-40 nucleotidos, preferentemente de 14-30, mas preferentemente de 16- 25, lo mas preferente de 18-22 nucleotidos de longitud, con la condicion de que dicha secuencia no es 5'-tcagtgatggttcaaagttc-3'

La presente invención se refiere a microbiología y a diagnósticos moleculares. Más específicamente, la presente invención se refiere a la detección específica y sensible de Neisseria gonorrhoeae (NG) en muestras clínicas.

infecciones, especialmente en las mujeres, son asintomáticas. Si permanecen sin descubrir, pueden resultar en una propagación a las parejas sexuales y en consecuencias a largo plazo tales como enfermedad inflamatoria pélvica, dolor pélvico crónico, embarazo ectópico, conjuntivitis neonatal e infertilidad (12). Por lo tanto, el diagnóstico exacto de infecciones sintomáticas y asintomáticas es crítico.

Se han desarrollado diferentes técnicas para detectar las infecciones genitales causadas por NG. El “estándar dorado” actual para el diagnóstico de la infección es cultivar en medio selectivo. Sin embargo, incluso bajo condiciones de laboratorio óptimas, la sensibilidad de los cultivos de gonococos está en el intervalo a partir de 85 hasta el 95% para la infección aguda (23) y cae aproximadamente un 50% para las hembras con infecciones crónicas (2) debido a una mala colección, transporte y almacenamiento de la muestra. Los métodos biológicos moleculares conocidos para la detección de NG incluyen técnicas basadas en la amplificación de ácidos nucleicos, que incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el ensayo de amplificación del desplazamiento de la hebra y PCR (1, 9, 14, 17, 19, 24, 28). Aunque estos métodos han mostrado alta sensibilidad y especificidad, cada uno de estos ensayos tiene limitaciones que incluyen sensibilidades variables a los inhibidores; reactividad cruzada con otros microorganismos, rendimiento limitado, altos costes y equipamiento dedicado. Por ejemplo, el ensayo Cobas Amplicor para NG (Cobas Amplicor CT/NG; Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey) produce resultados falsos positivos con determinadas cepas de N. subflava, N. cinerea y Lactobacillus, y es necesario un ensayo posterior de confirmación (11, 13, 22, 29). Los ensayos basados en los genes CppB y ARNr 16S se utilizan para la confirmación, sin embargo, de un 5 a 6% de cepas de NG no portan el plásmido CppB

(6), y no todos los ensayos basados en ARNr 16S son suficientemente sensibles y específicos(11, 30).

El ensayo de NG LCx® (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois) utiliza el método de amplificación del ácido nucleico LCR para detectar la presencia de ADN de NG directamente en muestras clínicas. Las cuatro sondas de oligonucleótidos en el ensayo LCx reconocen y se hibridan a una secuencia diana específica dentro de los genes Opa del ADN de NG (véase la Patente de EEUU Número 5.427.930). Los oligonucleótidos se diseñan para ser complementarios a la secuencia diana de manera que en presencia de la diana de NG, las sondas se unirán adyacentes una de la otra. A continuación, éstas pueden unirse de forma enzimática para formar el producto de amplificación que sirve posteriormente como secuencia diana adicional durante otras rondas de amplificación. El producto de la reacción de LCR se detecta en el analizador Abbott LCx.

Todas las cepas de meningococos y gonococos expresan las proteínas de opacidad (opa), denominadas así debido a su contribución a la opacidad de la colonia durante el crecimiento de las bacterias en placas de agar (26). Éstas son familia de las proteínas de membrana externa integrales básicas de aproximadamente 27 kDa. Se han identificado de once a trece genes opa individuales en NG, mientras que N. meningitides tienen menos (tres o cuatro) genes opa. Las proteínas similares a opa se expresan en diversos comensales de Neisseriaceae también (27). Los genes opa en NG están contenidos en lugares separados (opaA hasta -k) (4) y están sometidos a la variación de fase “on/off”. Cambios en la secuencia repetitiva dentro de los diferentes lugares de opa resulta en esta expresión variable en una sola bacteria (25). La expresión de opa se ha encontrado que promueve la adherencia de los gonococos a las células epiteliales, la entrada en las células epiteliales mediante la unión a los proteoglicanos de la superficie celular (3, 8, 16, 31, 32) e interacciones de los gonococos con los leucocitos polimorfonucleares (15). Además, la expresión de opa mejora la resistencia contra la destrucción mediada por el complemento (5).

Debido a que los genes opa son genes multicopia que se hospedan en regiones conservadas y codifican proteínas con funciones fisiológicas, los presentes inventores los han considerado como secuencias dianas adecuadas para un ensayo de amplificación PCR en tiempo real y se propusieron desarrollar un

ensayo basado en PCR específico y sensible para la detección de NG. Las secuencias que cubren una región conservada dentro de la región sin traducir 5' de los genes opa se obtuvieron de las bases de datos de NCBI. Sobre la base de la homología, se recuperaron secuencias de NG, N. meningitides y N. flava y se alinearon en la figura 1. Se diseñaron cebadores y una sonda de unión al surco menor (MGB) opa-1 (tabla 1) y se adaptaron a los estándares TaqMan utilizando el programa Primer Express (Applied Biosystems). El cebador de PCR directo utilizado en la presente invención (véase la tabla 1) se superpone parcialmente con la sonda de LCR 66.1 descrita en la patente de EEUU número 5.427.930. La sonda de oligonucleótidos opa-1 según la presente invención se superpone con los cinco nucleótidos en el extremo 3' de la sonda LCR 66.3 de US

5.427.930. Para optimizar el ensayo de PCR de NG basado en opa, se ensayó un panel de 448 cepas clínicas de NG (véase Materiales y Métodos). De estas 448 cepas, 424 generaron una señal fluorescente positiva en el PCR TaqMan que emplea la sonda opa-1 y 24 no generaron señal. Sin embargo, al analizar los productos de PCR de estas 24 cepas “aberrantes” de NG en gel de agarosa, las 24 mostraron abundantes productos de PCR del tamaño esperado. Al parecer, los productos de PCR amplificados (amplicones) de las cepas “aberrantes” no fueron detectados por la sonda opa-1. De forma sorprendente, el análisis de secuencia de los amplicones que fueron generados por el conjunto de cebadores pero que no fueron detectados por la sonda opa-1 reveló exactamente la misma secuencia para las 24 cepas aberrantes de NG (indicadas en la figura 1). Esta secuencia está caracterizada por la presencia de una secuencia de nucleótidos 5'-TTTGAACC-3', que no está presente en ninguna de las regiones 5' sin traducir de los genes opa conocidos obtenidos de la base de datos NCBI, basadas en las qué se diseñó la sonda opa-1. La secuencia de las cepas aberrantes muestra dos desajustes y una inserción comparadas con la secuencia de la sonda opa-1, que es al parecer suficiente para evitar que la sonda se hibride a la secuencia diana amplificada, es decir, la región del nucleótido en la posición 58 a la posición 40 localizada 5' del codón de iniciación de un gen que codifica una proteína de la opacidad de NG.

Por lo tanto, se diseñó una sonda nueva (opa-2) para detectar la secuencia amplificada de estas cepas aberrantes de NG. Se proporcionó un oligonucleótido específico de NG, que comprende

una secuencia de nucleótidos 5'-TTTGAACC-3', o su complemento, capaz de hibridizar a la región 5' sin traducir de un gen opa de NG que abarca los nucleótidos 57 a 50 localizados 5' del codón de iniciación de opa de NG (designado más adelante como secuencia diana) o su complemento. Esto significa que un nucleótido dentro del tramo de ocho nucleótidos puede ser sustituido por otro nucleótido, a condición de que el oligonucleótido pueda todavía reconocer y unirse a su secuencia diana. Preferentemente, la sustitución no implica la sustitución de los residuos T en el extremo 5', el residuo C o el residuo G en el extremo 3', ya que estos residuos representan los desajustes con la sonda opa-1 y son los posibles responsables del reconocimiento de las cepas aberrantes de NG.

Una secuencia complementaria 5'-tcagtgatggttcaaagttc-3' se conoce de la Patente de EEUU número 6.617.162. En este documento se utilizó como cebador que tenía como diana el ARN alfa receptor de estrógeno humano. De esta manera, puede que sea visto como anticipación accidental de la presente invención.

El término “oligonucleótido” se refiere a una secuencia corta de monómeros de nucleótidos unidos (por ejemplo, fosfodiéster, alquílico y aril-fosfato,...

1. Oligonucleótido específico de Neisseria gonorrhoeae, que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia 5'-TTTGAACC-3', o su complemento, capaz de hibridizar con la región 5' no traducida de un gen opa de NG o su complemento, en el que dicho oligonucleótido es de 12-40 nucleótidos, preferentemente de 14-30, más preferentemente de 1625, lo más preferente de 18-22 nucleótidos de longitud, con la condición de que dicha secuencia no es 5'-tcagtgatggttcaaagttc-3'.

2. Oligonucleótido, según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos 5'-CTTTGAACCATCAGTGAAA-3' o su complemento (sonda opa-2).

3. Oligonucleótido, según la reivindicación 1 ó 2, que comprende uno o más marcadores detectables, preferentemente un marcador cromóforo o fluorescente, más preferentemente un marcador seleccionado del grupo que comprende 6-FAM, HEX, JOE, TET, ROX, TAMRA, Fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5, Rojo Texas, Rodamina, Verde Rodamina, Rojo Rodamina, 6-CarboxiRodamine 6G, verde Oregón 488, verde Oregón 500, verde Oregón 514 DABCYL, BHQ-1 y BHQ-2.

4. Oligonucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho oligonucleótido es un conjugado oligonucleótido-unión al surco menor (MGB), en el que preferentemente MGB se selecciona del grupo que comprende un trímero de 1,2-dihidro-(3H)-pirrolo[3,2-e]indol-7-carboxilato (CDPI3) y un pentámero de N-metilpirrol4-carbox-2-amida (MPC5).

5. Método para detectar una cepa de Neisseria gonorrhoeae que comprende el uso de un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho método comprende preferentemente amplificación de ácidos nucleicos.

6. Método, según la reivindicación 5, que involucra la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferentemente la tecnología cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR), comprendiendo dicho método:

a) proporcionar el ADN de una cepa de NG o una muestra de ensayo que se sospecha que contiene ADN de dicha cepa de NG;

b) amplificar la región 5' no traducida de la región de un gen opa que comprende los nucleótidos 57 a 50 localizados 5' del codón de inicio de opa utilizando

un par de cebadores de amplificación de ácidos

nucleicos; y

c) detectar la presencia del producto de amplificación, una indicación de la presencia de NG, utilizando preferentemente, como mínimo, una sonda de detección capaz de hibridizarse al producto de amplificación;

en el que, como mínimo, un cebador o, como mínimo, una sonda de detección es un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Método, según la reivindicación 6, en el que dicho par de cebadores comprende opa Fw y opa Rv mostrados en la tabla 1.

8. Método, según la reivindicación 7, en el que dicha sonda de detección tiene la secuencia de nucleótidos 5'-CTT TGA ACC ATC AGT GAA A-3'.

9. Método, según la reivindicación 8, en el que se utiliza una sonda de detección adicional, preferentemente en el que dicha sonda de detección tiene la secuencia de nucleótidos 5'-CCC TTC AAC ATC AGT GAA A-3'.

10. Uso de un método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 para la detección, preferentemente la detección cuantitativa, de la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra clínica.

11. Kit para la detección de una cepa de Neisseria gonorrhoeae, que comprende un par de cebadores de amplificación de ácidos nucleicos capaces de amplificar una región que comprende los nucleótidos 57 a 50 localizados 5' del codón de inicio del gen opa de Neisseria gonorrhoeae y, como mínimo, una sonda de detección, en el que, como mínimo, un cebador y/o sonda de detección es un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, comprendiendo opcionalmente una polimerasa, preferentemente Taq polimerasa.

12. Kit, según la reivindicación 11, que comprende los cebadores opa Fw y opa Rv y la sonda de detección opa-2, opcionalmente comprendiendo además la sonda de detección opa-1.