CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DEPENDIENTE DE RECEPTORES DE ANDRÓGENOS INHIBIENDO LA ACTIVIDAD DE AMINA OXIDASA DE LA DEMETILASA LISINA-ESPECÍFICA (LSD1).

Uso de al menos un inhibidor de las amina oxidasas seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de pargilina,

clorgilina y deprenil para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata, donde el inhibidor de las amina oxidasas que es al menos uno inhibe a la LSD1 en complejo con AR y por consiguiente redunda en una disminución de la expresión génica AR-dependiente

Control de la expresión génica dependiente de receptores de andrógenos inhibiendo la actividad de amina oxidasa de la demetilasa lisina-específica (LSD1).

La presente invención se refiere al uso de al menos un inhibidor de las amina oxidasas seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de pargilina, clorgilina y deprenil para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata, donde el inhibidor de las amina oxidasas que es al menos uno inhibe a la LSD1 en complejo con AR y por consiguiente redunda en una disminución de la expresión génica AR-dependiente. La invención también se refiere a métodos de ensayo que permiten poner a prueba a los moduladores de la LSD1 con respecto a su capacidad para modular la función de LSD1, y preferiblemente para inhibirla.

El receptor de andrógenos (AR) es un miembro de la familia de receptores de hormonas esteroides de factores de transcripción que regulan diversas funciones biológicas entre las cuales se incluyen el crecimiento y la diferenciación celular, el desarrollo, la homeostasis y varias funciones orgánicas en un mamífero, y en particular en un humano. Uniendo ligandos adecuados tales como andrógenos al dominio de unión de ligandos, son activadas funciones del AR que son esenciales para la diferenciación, el desarrollo y el mantenimiento de los órganos reproductores masculinos o femeninos y de órganos no reproductores, (tales como por ejemplo la próstata o las mamas).

La regulación transcripcional por medio de receptores nucleares tales como el receptor de andrógenos (AR) implica una interacción con múltiples factores que actúan de manera tanto secuencial como combinatoria para reorganizar la cromatina¹. Ocupa un lugar central en esta reorganización dinámica la modificación de las histonas nucleares. Las colas N-terminales de las histonas son sometidas a varias modificaciones covalentes tales como acetilación, fosforilación, ubiquitinación y metilación por específicas enzimas² modificadoras de la cromatina. La metilación de la histona en residuos de lisina específicos está vinculada tanto con la activación² como con la represión transcripcional. Al buscarse nuevas proteínas que interactúan con el AR, se comprobó que la demetilasa 1 lisina-específica (LSD1)³ es un ejemplo de las enzimas modificadoras de la cromatina.

La LSD1 contiene un dominio de SWIRM (dominio de SWIRM = dominio de las proteínas SWI3, RSC8 y MOIRA) situado centralmente que funciona como un putativo motivo de interacción de proteína-proteína, y también contiene un dominio de amina oxidasa (AO) C-terminal que alberga la actividad de demetilasa³ (Fig. 1b). La LSD1 y el AR endógenos se asocian in vivo en tejidos sensibles a los andrógenos, tales como el testículo (Fig. 1a). Para mapear el dominio de interacción entre la LSD1 y el AR in vitro, fueron llevados a cabo análisis pull-down con LSD1 etiquetada y mutantes de la misma junto con proteínas de fusión de GST-AR. Como se muestra en la figura 1b, la LSD1 de longitud completa, así como el dominio de SWIRM (175-246 de LSD1) y el dominio de AO (247-852 de LSD1) se asocian con el terminal N (NTD), el dominio de unión de DNA (DBD), o el dominio de unión de ligandos (LBD) del AR. En contraste con ello, ni el terminal N de la LSD1 (1-174 de LSD1) ni el control de GST interactúan con el AR.

El documento WO-A 02/19.964 dio a conocer el uso del inhibidor de la MAO-B (MAO-B = monoaminooxidasa B) desmetil-selegelina para el tratamiento de enfermedades neoplásicas o estados que incluyen a una serie de tumores, incluyendo los tumores de próstata.

El documento "Y. Shi et al., Histone Demethylation mediated by the Nuclear Amine Oxidase Homolog LSD1, Cell 119 (2004), 941-953" se refiere a la evidencia de que la LSD1, que es un homólogo nuclear de amina oxidasas, funciona como una histona demetilasa y un correpresor transcripcional desmetilando LSD1-específicamente la histona H3 lisina 4, que está vinculada a la transcripción activa.

Las mismas revelaciones pueden encontrarse en los documentos "S. Kubicek et al., A crack in Histone Lysine Methylation, Cell 119 (2004), 903 a 906" y "J. Couzin, Long-Sought Enzyme Found - Revealing New Gene Switch on Histones, Science 306 (2004), 2171".

Se ha descubierto ahora sorprendentemente que la enzima desmetilante LSD1 es expresada ubicuamente en tejidos fetales y adultos humanos y murinos (Figura 2a y datos no ilustrados). Además se detectó también que la LSD1 se encuentra en las mismas células (y en las mismas áreas subcelulares) donde está situado el AR (Figuras 2c, d). En el curso de la investigación que ha redundado en la presente invención, los anteriores (y adicionales) hallazgos llevaron a la conclusión de que la enzima desmetilante LSD1 puede ejercer una influencia controladora en la expresión génica andrógeno-dependiente.

El documento "Kubicek S. and Jenuwein T., A crack in histone lysine methylation, Cell 119 (2004), 903-6" comenta los hallazgos de Shi et al. a los que se ha aludido anteriormente y aporta adicional información de fondo.

El documento "Couzin J., Molecular biolog. Long-sought enzyme found, revealing new gene switch on histones, Science 306 (2004), 2171" resume los descubrimientos sobre enzimas que actúan como demetilasas en las histonas.

El documento "Chen D. et al., Regulation of transcription by a protein methyltransferase, Science 284 (1999), 2174-7" da a conocer la CARM1 (CARM1 = arginina metiltransferasa 1 asociada a coactivador) y su función como coactivador secundario.

El documento "Heinlein C. and Chang C., Androgen receptor (AR) coregulators: an overview, Endrocr. Rev 23(2002), 175-200" da información sobre la regulación del receptor de andrógenos.

En la siguiente descripción se explica más ampliamente la invención haciendo referencia a las Figuras.

En las Figuras:

La Figura 1 muestra lo siguiente: (a) la LSD1 interactúa con AR y LSD1 in vivo e in vitro. (b) el AR coinmunoprecipita con LSD1. Extractos de testículo de ratón fueron inmunoprecipitados con un anticuerpo α-LSD1 o IgG de conejo de control. El diez por ciento del extracto usado para la inmunoprecipitación fue cargado como entrada. Los Western-blots fueron decorados con anticuerpos α-AR y α-LSD1. a, Fueron llevados a cabo ensayos pull-down de GST con mutantes de LSD1 etiquetados y las correspondientes proteínas de fusión de GST-AR expresadas bacterialmente (KCl 150 mM/NP40 al 0,15%). Se usaron como control proteínas GST. (NTD; dominio N-terminal, DBD; dominio de unión de DNA, LBD; dominio de unión de ligandos).

La Figura 2 muestra análisis de expresión de LSD1. La expresión de mRNA de LSD1 en tejidos humanos fue examinada mediante análisis Northern blot en un Conjunto de Expresión Tisular Múltiple Humana (a) y un Northern blot de testículo humano (b). (c): Coloración inmunohistoquímica de LSD1 y AR en próstata normal y tumoral humana. Se detecta inmunorreactividad para LSD1 (A, B) y AR (C, D) en el epitelio secretorio de células de próstata normales (A, C, flechas) y tumorales (B, D, flechas). Todas las secciones se tomaron de la misma muestra de prostatectomía radical. Ampliación: 250 aumentos. (d) Localización subcelular de la LSD1 y del AR endógenos en las células de tumor de próstata LNCaP humanas. El AR (rojo) se colocaliza con la LSD1 (verde) en el núcleo tras la adición del agonista de AR +R1881.

La Figura 3 muestra cómo la LSD1 interactúa con la cromatina: (a) La coloración con azul de Coomassie revela la interacción de GST-LSD1 expresada bacterialmente con histonas nucleares in vitro (KCl 600 mM/NP40 al 0,3%). (b): La LSD1 etiquetada interactúa con la cola N-terminal de histona H3 acoplada a sefarosa. Las células LNCaP fueron incubadas con o sin R1881 (c, d, e), tratadas con o sin pargilina (d) o transfectadas con siRNA (siRNA = ARN pequeño de interferencia) (e). Fueron llevadas a cabo ChIP (ChIP = inmunoprecipitación de cromatina) o Re-ChIP (Re-ChIP = inmunoprecipitación secuencial de cromatina) con los anticuerpos indicados. La cromatina precipitada fue amplificada mediante PCR (PCR = reacción cadena de la polimerasa) usando los cebadores que flanquean a la región promotora (ARE I+II), la región central (centro) o la región potenciadora (ARE III) del gen PSA regulado por AR. El silenciamiento ("knockdown") de la LSD1 mediado por siRNA se verifica...

1. Uso de al menos un inhibidor de las amina oxidasas seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de pargilina, clorgilina y deprenil para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata, donde el inhibidor de las amina oxidasas que es al menos uno inhibe a la LSD1 en complejo con AR y por consiguiente redunda en una disminución de la expresión génica AR-dependiente.

2. Uso según la reivindicación 1, donde el inhibidor de las amina oxidasas es pargilina.

3. Método de ensayo que permite poner a prueba a los moduladores de la LSD1 con respecto a su capacidad para modular la función de LSD1, donde al menos una sustancia química que supuestamente ejerce modulación de dicha función de LSD1 es sometida a una o varias reacciones de desmetilación de mono- y dimetil H3-K9, donde dicha LSD1 está implicada bajo condiciones que son similares o idénticas a las condiciones fisiológicas.

4. Método de ensayo que permite poner a prueba a los moduladores de la LSD1 con respecto a su capacidad para modular la función de LSD1, donde al menos una sustancia química que supuestamente ejerce modulación de dicha función de LSD1 es sometida a la reacción de superacción ligando-dependiente inducida por LSD1 de AR en células 293 o CV-1, modulando así la actividad de AR ligando-dependiente, y preferiblemente bloqueándola.

5. Método de ensayo que permite poner a prueba a los moduladores de la LSD1 con respecto a su capacidad para modular la función de LSD1, donde al menos una sustancia química que supuestamente ejerce modulación de dicha función de LSD1 es sometida a la reacción de proliferación de células LNCaP o MCF-7 andrógeno-dependiente, modulando así dicha proliferación celular andrógeno-dependiente, y preferiblemente bloqueándola.