CONDROITINA-POLIMERASA Y ADN QUE LA CODIFICA.

Proteína aislada seleccionada de entre el grupo constituido por los siguientes apartados

(A) y (B): (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 2; (B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E02017764.

Solicitante: SEIKAGAKU CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 6-1, MARUNOUCHI, 1-CHOME CHIYODA-KU, TOKYO 100-0005 JAPON.

Inventor/es: Ninomiya,Toshio, Sugiura,Nobuo, Kimata,Koji,Room 1201,Esupoa-Yashiroguchi.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 9 de Agosto de 2002.

Clasificación PCT:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/31 (Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/54 (Transferasas (2))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/10 (Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos que contienen radicales... > C12P19/18 (preparados por acción de una transferasa glicosílica, p. ej. alfa-, beta- o gamma-ciclodextrinas)

Clasificación antigua:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/31 (Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/54 (Transferasas (2))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/10 (Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos que contienen radicales... > C12P19/18 (preparados por acción de una transferasa glicosílica, p. ej. alfa-, beta- o gamma-ciclodextrinas)

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2365388_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere a una nueva condroitina-polimerasa (condroitina-sintasa), a un ADN que la codifica, a un procedimiento para producir la condroitina-polimerasa, a un procedimiento para producir una cadena de azúcar que contiene la unidad de condroitina disacarídica repetitiva, a una sonda de hibridación para la condroitinapolimerasa y similares. 2. Breve descripción de la técnica anterior En primer lugar, se describen las abreviaturas utilizadas frecuentemente en la presente memoria. En las fórmulas y similares, "GlcUA", "GalNAc", "GlcNAc", "UDP" y "-" representan ácido D-glucurónico, N-acetil-Dgalactosamina; N-acetil-D-glucosamina; uridina 5'-difosfato y un enlace glucosídico, respectivamente. Condroitina es una cadena de azúcar que comprende una estructura disacarídica repetitiva del resto GlcUA y del resto GalNAc (-GlcUAß(1-3)- GalNAcß(1-4)); denominada también en lo sucesivo "estructura de condroitina") y una cadena de azúcar en la que la condroitina que está más sulfatada es el sulfato de condroitina. En cuanto a una enzima que sintetiza condroitina procedente de un donante de GlcUA y de un donante de GalNAc transfiriendo alternativamente GlcUA y GalNAc a un aceptor (condroitina-polimerasa o condroitina-sintasa) y ADN que codifica la misma, solamente se conoce una condroitina-sintasa de Pasteurella multocida (J. Biol. Chem., 215(31), 24124-24129 (2000)). Además, determinadas cepas de Escherichia coli (serotipo 05:K4(L):H4 de Escherichia coli, denominado en lo sucesivo "cepa K4 de Escherichia coli") producen un polisacárido con estructura de condroitina, como antígeno capsular, pero su estructura es una estructura trisacarídica repetitiva en la que la fructosa está unida a una cadena lateral del resto GlcUA en la posición ß2-3. Por consiguiente, no estaba claro si la cepa K4 de Escherichia coli realmente tiene una condroitina-polimerasa como su propio sistema de síntesis del antígeno capsular. Sumario de la invención Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una nueva condroitina-polimerasa, un ADN que codifica la misma, un procedimiento para producir la condroitina-polimerasa, un procedimiento para producir la cadena de azúcar que contiene la unidad de condroitina polisacarídica repetitiva, una sonda de hibridación para la condroitina-polimerasa y similares. Este y otros objetivos de la presente invención se alcanzan mediante una nueva condroitina-polimerasa con las propiedades específicas descritas a continuación. Breve descripción de los dibujos ES 2 365 388 T3 La figura 1 presenta una cartografía de restricción de los clones del fago que contienen una parte de la zona R-I o de la zona R-III del grupo génico del antígeno K de la cepa K4 de Escherichia coli. La figura 2 presenta el marco abierto de lectura (ORF) de la región R-II del grupo génico del antígeno K de la cepa K4 de Escherichia coli. La figura 3 es un gráfico que presenta la transferencia de GalNAc al hexasacárido del sulfato de condroitina C por la enzima de la presente invención. La figura 4 es un gráfico que presenta la transferencia de GalNAc al hexasacárido del sulfato de condroitina C por la enzima de la presente invención y las dimensiones de la cadena de azúcar producida. La figura 5 es un gráfico que presenta la transferencia de cada monosacárido cuando se utilizó como donante UDP- GlcUA, UDP-GlcNAc o UDP-GalNAc, y se utilizó como aceptor hexasacárido o heptasacárido de sulfato de condroitina C. La figura 6 es un gráfico que presenta la influencia de la temperatura sobre la actividad de la enzima de la presente invención. 2 La figura 7 es un gráfico que presenta los modelos de filtración en gel de los productos de la reacción enzimática después de varios periodos de reacción enzimática. La figura 8 es un gráfico que presenta la relación entre el periodo de reacción enzimática y la cantidad de incorporación de radioactividad. La figura 9 es un gráfico que presenta la relación entre la radioactividad incorporada (V) y la concentración en el sustrato de UDP-azúcar (S). La figura 10 es un gráfico que presenta representaciones recíprocas dobles. Descripción detallada de la invención Los presentes inventores han llevado a cabo intensos estudios y han descubierto una nueva condroitina-polimerasa producida por microorganismos específicos (cepa 4 de Escherichia coli (serotipo 05:K4(L):H4 de Escherichia coli, ATCC 23502)), ADNc aislado que codifica la condroitina-polimerasa, y ha logrado preparar la condroitina-polimerasa utilizando el ADNc. De este modo, se ha realizado la presente invención. Además, este y otros objetivos de la presente invención se han alcanzado mediante un procedimiento para producir la condroitina-polimerasa aislando el ADNc que codifica la condroitina-polimerasa y utilizando el ADNc. La expresión "síntesis de condroitina" tal como se utiliza en la presente memoria es un concepto que incluye el alargamiento de la cadena de azúcar de condroitina transfiriendo y agregando monosacáridos a una cadena de azúcar tal como condroitina. Por consiguiente, la reacción para alargar la cadena de azúcar de condroitina transfiriendo alternativamente y añadiendo los monosacáridos (GlcUA y GalNAc) a la cadena de azúcar para sintetizar la condroitina está incluida en un concepto de "síntesis de condroitina". En la presente memoria se describe una condroitina-polimerasa (en lo sucesivo denominada también "enzima de la presente invención) que tiene las propiedades siguientes: (1) Acción: la polimerasa transfiere GlcUA y GalNAc alternativamente a un terminal no reducido de una cadena de azúcar de un donante de GlcUA y de un donante de GalNAc, respectivamente; (2) Especificidad de sustrato: la polimerasa transfiere GlcUA a un oligosacárido que tiene GalNAc en su terminal no reducido y una estructura de condroitina de un donante de GlcUA, pero no transfiere sustancialmente GalNAc al oligosacárido de un donante de GalNAc; la polimerasa transfiere GalNAc a un oligosacárido que tiene GlcUA en su terminal no reducido y una estructura de condroitina de un donante de GalNAc, pero no transfiere sustancialmente GlcUA al oligosacárido de un donante de GlcUA; (3) Influencia de los iones metálicos y similares: ES 2 365 388 T3 La polimerasa actúa en presencia de ión Mn 2+ pero no actúa sustancialmente en presencia de ión Ca 2+ , ión Cu 2+ o ácido etilendiamintetraacético. La enzima descrita en la presente memoria procede preferentemente de Escherichia coli. La presente invención se refiere a una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por los siguientes apartados (A) y (B) (denominada en lo sucesivo "proteína de la presente invención"): (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2; (B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa. La presente invención se refiere a un ADN que comprende uno de los siguientes apartados (a) a (c) (denominado en lo sucesivo "ADN de la presente invención"): (a) ADN que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2; (b) ADN que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de 3 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa; (c) ADN que se hibrida con (i) el ADN en (a), o (ii) el ADN complementario al ADN en (a) en condiciones severas en las que la hibridación se realiza a 42ºC en una solución que contiene 50% de formamida, 4 x SSC, HEPES 50 mM (pH 7,0), 10 x solución de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Proteína aislada seleccionada de entre el grupo constituido por los siguientes apartados (A) y (B): (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 2; (B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa. 2. Proteína según la reivindicación 1, en la que la proteína está en forma soluble. 3. ADN que comprende uno de los siguientes apartados (a) a (c): (a) ADN que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 2; (b) ADN que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa; (c) ADN que se hibrida a (i) el ADN en el apartado (a), o (ii) un ADN complementario al ADN en el apartado (a) en condiciones severas en las que la hibridación se realiza a 42ºC en una solución que contiene 50% de formamida, 4 x SSC, HEPES 50 mM (pH 7,0), 10 x solución de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, y que codifica una proteína que tiene actividad de condroitina-polimerasa. 4. ADN según la reivindicación 3, en el que el ADN en el apartado (a) esta representado por la SEC. ID. nº 1. 5. Vector que comprende el ADN de la reivindicación 3 ó 4. 6. Vector según la reivindicación 5, que es un vector de expresión. 7. Transformante en el que un hospedador se transforma con el vector de la reivindicación 5 ó 6. 8. Procedimiento para producir una condroitina-polimerasa, que comprende: cultivar el transformante de la reivindicación 7; y recoger la condroitina-polimerasa del material cultivado. 9. Agente para la síntesis de la cadena de azúcar, que comprende la proteína de la reivindicación 1 ó 2 y que tiene actividad de condroitina-polimerasa. 10. Procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula (3) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la reivindicación 9 ponerse en contacto con un donante de GalNAc y una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente: GlcUA-X-R 1 (1) GalNAc-GlcUA-X-R 1 (3) en las que GlcUA representa ácido D-glucurónico; GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; X representa GalNAc o GlcNAc en la que GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; - representa un enlace glucosídico y R 1 representa cualquier grupo. 11. Procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula (4) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la reivindicación 9 ponerse en contacto con un donante de GalNAc y una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente: (1) GlcUA-X-R 1 GlcNAc-GlcUA-X-R 1 (4) ES 2 365 388 T3 en las que GlcUA representa ácido D-glucurónico; GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; X representa GalNAc o GlcNAc en la que GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; - representa un enlace glucosídico y R 1 representa 33 cualquier grupo. 12. Procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula (5) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la reivindicación 9 ponerse en contacto con un donante de GlcUA y una cadena de azúcar representada por la fórmula (2) siguiente: (2) GlcUA-GalNAc-GlcUA-R 2 (5) GalNAc-GlcUA-R 2 en las que GlcUA representa ácido D-glucurónico; GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; X representa GalNAc o GlcNAc en la que GlcNAc representa N-acetil-D-glucosamina; - representa un enlace glucosídico y R 2 representa cualquier grupo. 13. Procedimiento para producir una cadena de azúcar seleccionada de entre las fórmulas (6) y (8) siguientes, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la reivindicación 9 ponerse en contacto con un donante de GalNAc, con un donante de GlcUA y con una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente: GlcUA-X-R 1 (1) (GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R 1 (6) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R 1 (8) en las que GlcUA representa ácido D-glucurónico; GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; X representa GalNAc o GlcNAc en la que GlcNAc representa N-acetil-D-glucosamina; - representa un enlace glucosídico; R 1 representa cualquier grupo; y n es un número entero de 1 ó más. 14. Procedimiento para producir una cadena de azúcar seleccionada de entre las fórmulas (7) y (9) siguientes, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la reivindicación 9 ponerse en contacto con un donante de GalNAc, con un donante de GlcUA y con una cadena de azúcar representada por la fórmula (2) siguiente: GalNAc-GlcUA-R 2 (2) (GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R 2 GlcUA-(GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R 2 ES 2 365 388 T3 (7) (9) en las que GlcUA representa ácido D-glucurónico; GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; - representa un enlace glucosídico; R 2 representa cualquier grupo; y n es un número entero de 1 ó más. 15. Sonda de hibridación que comprende una secuencia nucleotídica complementaria de la secuencia nucleotídica representada por SEC. ID. nº 1. 16. Catalizador de transferencia de glucosilo que comprende la proteína de la reivindicación 1 ó 2 y que tiene actividad de condroitina-polimerasa. 34 ES 2 365 388 T3 ES 2 365 388 T3 36 ES 2 365 388 T3 37 ES 2 365 388 T3 38 ES 2 365 388 T3 39