COMPOSICIONES, MÉTODOS Y EQUIPOS PARA LA DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DEL VIH-1 Y VIH-2.

Un método para determinar si una muestra de ensayo contiene al menos uno de los ácidos nucleicos de VIH-1 y VIH-2,

dicho método comprende los pasos de: (a) combinar dicha muestra de ensayo con un par de los cebadores con reactividad cruzada para formar una mezcla de reacción, en el que dicho par de cebadores con reactividad cruzada es capaz de coamplificar ácidos nucleicos de VIH-1 y VIH-2 y comprende una primera secuencia de cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº:14, que comprende opcional-mente una secuencia río arriba que no es complementaria a ningún ácido nucleico de VIH-1 o VIH-2, y una segunda secuencia de cebador que consiste en cualquiera de Id. de Sec. Nº:2 o Id. de Sec. Nº:7, que comprende opcionalmente una secuencia río arriba que no es complementaria a ningún ácido nucleico de VIH-1 o VIH-2; (b) amplificar, en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos in vitro, los ácidos nucleicos presentes en dicha mezcla de reacción del paso (a); y (c) detectar en una reacción de hibridación un amplicón de VIH-1, un amplicón de VIH-2, o una combinación de ambos amplicones sintetizados en el paso (b), determinando de este modo que dicha muestra de ensayo contiene al menos uno de los ácidos nucleicos de VIH-1 y VIH-2

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2004/042899.

Solicitante: GEN-PROBE INCORPORATED.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 10210 GENETIC CENTER DRIVE SAN DIEGO, CA 92121 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: LINNEN, JEFFREY M., WU,WEN.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 16 de Diciembre de 2004.

Fecha Concesión Europea: 25 de Agosto de 2010.

Clasificación PCT:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C12Q1/70 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen virus o bacteriófagos.

Clasificación antigua:

  • C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C12Q1/70 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen virus o bacteriófagos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania.


Fragmento de la descripción:

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología. Más específicamente, la invención está relacionada con individual ensayos que pueden detectar los ácidos nucleicos del VIH-1, VIH-2 o la combinación de VIH-1 y VIH-2. La invención además está relacionada con los ensayos multiplex que pueden detectar los ácidos nucleicos tanto del VIH-1 como del VIH-2 utilizando una sonda y/o ceba-dores con reacción cruzada con los dos analitos.

Interés gubernamental de la invención

Ciertos aspectos de la invención aquí descrita se realizaron con el apoyo del gobierno bajo los contratos del National Heart, Lung and Blood Institute del National Institutes of Health N01-HB-67130 y N01-HB-07148. El gobierno de los Estados Unidos posee ciertos derechos en estos aspectos de la invención.

Antecedentes de la invención

Aunque la pandemia de VIH/ SIDA se debe principalmente a la infección por el VIH-1, un retrovirus diferente ha emergido como causante de SIDA. Este virus llamado "VIH-2" se aisló por primera vez a partir de SIDA en el oeste de África en 1986, y se detectó posteriormente como un agente infeccioso por primera vez en los Estados Unidos el año si

guiente. En los Estados Unidos se han informado menos de 100 casos de VIH-2 hasta finales de 1994. A pesar de estos valores aparentemente bajos, se ha identificado el VIH-2 como un agente etiológico en crecimiento causante de enfermedades con inmunosupresión que son clínicamente indistinguibles de los casos de SIDA resultantes de una infección por VIH-1 (Kanki et al., Science 232:238 (1986); Kanki et al., Science 236:827 (1987); Clavel et al., Science 233:343 (1986); Clavel et al., N. Engl. J. Med. 316:1180 (1987)). Aunque el VIH-2 está relacionado con el VIH-1 en cuanto a su morfología y tropismo por las células CD4+, éste es claramente un virus distinto y no meramente una variante de la cubierta del VIH-1.

Además, como el VIH-2 sólo está relacionado de forma lejana con el VIH-1, con aproximadamente un 50% de aminoácidos conservados en las proteínas gag y pol y menos de un 30% de conservación en los productos génicos env, su presencia no se detecta de forma efectiva en los ensayos serológicos utilizados para la detección de la infección por VIH-1 (Constantine NT, SIDA 7:1 (1993); Markovitz DM, Ann. Intern. Med. 118:211 (1993)). En consecuencia, se han intentado desarrollar sondas de ácidos nucleicos que puedan utilizarse para detectar de forma específica los ácidos nucleicos virales del VIH-2.

De forma interesante, los genomas tanto del VIH-1 como del VIH-2 muestran una heterogeneidad de secuencia sustancial entre diferentes aislamientos. Como consecuencia de esta heterogeneidad, ha sido imposible encontrar regiones

sustanciales con una conservación absoluta de la secuencia entre todos los aislamientos del VIH-1 o todos los aislamientos del VIH-2 (véase la solicitud de patente europea publicada PE 0 887 427). Además, se han identificado numerosos aislamientos virales con secuencias de polinucleótido únicas para cada uno de estos virus, un factor que además complica la construcción de sondas para un análisis de ácidos nucleicos fiable y efectivo.

Ya que el VIH-2, como el VIH-1, también es transmisible a través de un intercambio de fluidos corporales, lo que incluye sangre y plasma, es importante poder detectar los fluidos corporales infectados antes de que los anticuerpos del virus sean detectables o los síntomas sean evidentes en un individuo infectado. Para la protección de los pacientes, que de otro modo podrían recibir un fluido corporal infectado con VIH-2 (por ejemplo sangre total o plasma durante una transfusión), o productos derivados de sangre o plasma de donaciones, es particularmente importante detectar la presencia de virus en los fluidos corporales de donación para evitar su utilización en tales procedimientos

o productos. También es importante que los procedimientos y reactivos utilizados para la detección del VIH-2 puedan detectar un número relativamente bajos de copias virales que pueden estar presentes en un individuo infectado, que puede ser un donante, durante las fases tempranas de la infección.

Se han descrito previamente ensayos y reactivos para

la detección del VIH-2 en, por ejemplo, las patentes esta

dounidenses Nº 6.020.123, 5.688.637, 5.545.726 y 5.310.651; las patentes europeas Nº PE 0404625 B1 y PE 0239425 B1; y las solicitudes de patente europea publicadas Nº PE 1026236 A2 y PE 0887427 A2.

Resumen de la invención

Un primer aspecto de la descripción está relacionada con un método para determinar si una muestra de ensayo contiene ácidos nucleicos analito del VIH-1 o ácidos nucleicos analito del VIH-2. El método incluye una primera fase en la que se combina la muestra de ensayo con un par de cebadores con reactividad cruzada. A continuación, hay un paso de amplificación en una reacción de amplificación in vitro de ácidos nucleicos de una de entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos analito del VIH-1 que pueden estar presentes en la muestra de ensayo y de una de entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos analito del VIH-2 que pueden estar presentes en la muestra de ensayo. Esta reacción de amplificación de ácidos nucleicos utiliza un par de cebadores con reactividad cruzada que pueden coamplificar los ácidos nucleicos de VIH-1 y VIH-2. Los productos de la reacción pueden incluir un primer amplicón del VIH-1 y un primer amplicón del VIH-2. A continuación, hay una fase de detección en una única reacción de hibridación de uno de entre cualquiera de los primeros amplicones del VIH-1 y de uno de entre cualquiera de los primeros amplicones del VIH-2 que pueden haberse sintetizado en la fase de amplificación. Un resultado positivo en la reacción de hibridación indicará que la muestra de ensayo contenía al

menos un ácido nucleico analito del VIH-1 o un ácido nucleico analito del VIH-2. En una realización preferible, la reacción de amplificación in vitro de ácidos nucleicos en la fase de amplificación es una reacción de TMA, una reacción de NASBA o una reacción de PCR. En otra realización preferible, la única reacción de hibridación de la fase de detección involucra la utilización de una sonda con reactividad cruzada que puede hibridar con el primer amplicón del VIH-1 o con el primer amplicón del VIH-2. Más preferiblemente, la reacción de hibridación en la fase de detección además incluye una sonda específica del VIH-1 que hibrida sólo con el primer amplicón del VIH-1 y no con el primer amplicón del VIH-2. Cuando este es el caso, una señal positiva que indica la hibridación de la sonda con reactividad cruzada junto con la ausencia de un señal positiva indicativa de hibridación de la sonda específica del VIH-1 indica que la muestra de ensayo contiene los ácidos nucleicos analito del VIH-2 y no contiene los ácidos nucleicos analito del VIH-1. En una realización preferible alternativa, hay una fase adicional de detección en una reacción de hibridación que incluye una sonda específica del VIH-1, sólo del primer amplicón del VIH-1, y no se detecta el primer amplicón del VIH-2. En este ejemplo, la sonda específica del VIH-1 hibrida solamente con el primer amplicón del VIH-1 y no con el primer amplicón del VIH-2. Cuando este es el caso, una señal positiva que indica hibridación de la sonda con reactividad cruzada junto con la ausencia de una señal positiva que indica hibridación de la sonda específica del

VIH-1 indica que la muestra de ensayo contiene los ácidos nucleicos analito del VIH-2 y no contiene los ácidos nucleicos analito del VIH-1. De acuerdo con otra realización preferible, la sonda con reactividad cruzada utilizada en la fase de detección está marcada con una señal detectable de forma homogénea. La señal detectable de forma homogénea puede ser, por ejemplo, un marcaje quimioluminiscente. En una realización altamente preferible, cuando se utiliza un marcaje quimioluminiscente, la fase de detección involucra la detección con un luminómetro, o realizar una luminometría. En ciertas realizaciones distintas del método, la reacción de amplificación in vitro de ácidos nucleicos realizada en la fase de amplificación no incluye un par de ceba-dores específicos del analito que amplifiquen la primera secuencia de ácidos nucleicos analito del VIH-2 sin amplificar también una primera secuencia de ácidos nucleicos analito del VIH-1. En otras realizaciones, un resultado positivo que indica una hibridación de la sonda en la fase...

 


Reivindicaciones:

1. Un método para determinar si una muestra de ensayo contiene al menos uno de los ácidos nucleicos de VIH-1 y VIH-2, dicho método comprende los pasos de:

(a) combinar dicha muestra de ensayo con un par de los cebadores con reactividad cruzada para formar una mezcla de reacción, en el que dicho par de cebadores con reactividad cruzada es capaz de coamplificar ácidos nucleicos de VIH-1 y VIH-2 y comprende una primera secuencia de cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº:14, que comprende opcional-mente una secuencia río arriba que no es complementaria a ningún ácido nucleico de VIH-1 o VIH-2, y una segunda secuencia de cebador que consiste en cualquiera de Id. de Sec. Nº:2 o Id. de Sec. Nº:7, que comprende opcionalmente una secuencia río arriba que no es complementaria a ningún ácido nucleico de VIH-1 o VIH-2;

(b) amplificar, en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos in vitro, los ácidos nucleicos presentes en dicha mezcla de reacción del paso (a); y

(c) detectar en una reacción de hibridación un amplicón de VIH-1, un amplicón de VIH-2, o una combinación de ambos amplicones sintetizados en el paso (b), determinando de este modo que dicha muestra de ensayo contiene al menos uno de los ácidos nucleicos de VIH-1 y VIH-2.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha reacción de amplificación de ácidos nucleicos in vitro el paso de amplificación, se selecciona de entre el grupo que consiste en una reacción de amplificación mediada por la

transcripción (AMT), una reacción de amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) y una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha reacción de hibridación en el paso de detección comprende una sonda con reactividad cruzada que hibrida independientemente con dicho amplicón de VIH-1 y a dicho amplicón de VIH-2.

4. El método de la reivindicación 3, en el que dicha reacción de hibridación en el paso de detección además comprende una sonda específica de VIH-1 que hibrida sólo con dicho amplicón de VIH-1 y no con dicho amplicón de VIH-2.

5. El método de la reivindicación 4, en el que una señal positiva que indica hibridación de la sonda con reactividad cruzada junto con la ausencia de una señal positiva que indica hibridación de la sonda específica de VIH-1 indica que dicha muestra de ensayo contiene ácidos nucleicos de VIH-2 y no contiene ácidos nucleicos de VIH-1.

6. El método de la reivindicación 3, que comprende además un paso para la detección en una reacción de hibridación que comprende una sonda específica de VIH-1, dicho amplicón de VIH-1 sin también detectar dicho amplicón de VIH-2, en el que dicha sonda específica de VIH-1 hibrida sólo con dicho amplicón de VIH-1 y no con dicho amplicón de VIH-2.

7. El método de la reivindicación 6, en el que una señal positiva que indica hibridación de la sonda con reactividad cruzada junto con la ausencia de una señal positiva

que indica hibridación de la sonda específica de VIH-1 que indica que dicha muestra de ensayo contiene ácidos nucleicos de VIH-2 y no contiene ácidos nucleicos de VIH-1.

8. El método de la reivindicación 3, en el que dicha sonda con reactividad cruzada está marcada con un marcaje homogéneamente detectable.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho marcaje homogéneamente detectable es un marcaje quimioluminiscente.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho paso de detección comprende la detección con un luminómetro.

11. El método de la reivindicación 1, en el que un resultado positivo obtenido en dicho paso de detección no distingue entre dicho amplicón de VIH-1 y dicho amplicón de VIH-2.

12. El método de la reivindicación 1, en el que dicha reacción de amplificación de ácidos nucleicos in vitro en el paso de amplificación es una reacción de amplificación multiplex que puede además amplificar, con una serie de cebadores específicos de diana, al menos un ácido nucleico que es diferente de VIH-1 y VIH-2.

13. El método de la reivindicación 12, en el que dicho al menos un ácido nucleico que es diferente de VIH-1 y VIH2 se selecciona del grupo que consiste en VHB y VHC.

14. Una composición para amplificar cualquier analito de ácidos nucleicos de VIH-1 y cualquier analito de ácidos nucleicos de VIH-2 que puede estar presente en una muestra

biológica, que comprende:

(a) un primer cebador que consiste de Id. de Sec. Nº:14, que comprende opcionalmente una primera secuencia de cebador río arriba que no es complementario a ninguno de dichos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2; y

(b) un segundo cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº:2 o Id. de Sec. Nº:7, que comprende opcionalmente una segunda secuencia de cebador río arriba que no es complementario a ninguno de dichos ácidos nucleicos de VIH-1 o VIH-2.

15. La composición de la reivindicación 14, en el que el primer cebador tiene hasta 75 bases de longitud, y en el que el segundo cebador consiste en el Id. de Sec. Nº:2.

16. La composición de la reivindicación 14, en el que el primer cebador tiene hasta 75 bases de longitud, y en el que el segundo cebador consiste en el Id. de Sec. Nº:7.

17. Una composición para amplificar cualquier analito de ácidos nucleicos de VIH-1 y cualquier analito de ácidos nucleicos de VIH-2 que puede estar presente en una muestra biológica, que comprende:

(a) un primer cebador que consiste en cualquiera de Id. de Sec. Nº:13, Id. de Sec. Nº:14 o Id. de Sec. Nº:15, dicho primer cebador opcionalmente comprende una primera secuencia de cebador río arriba que no es complementaria a ninguno de dichos ácidos nucleicos de VIH-l o VIH-2; y

(b) un segundo cebador que consiste en el Id. de Sec. Nº:2, que comprende opcionalmente una segunda secuencia de cebador río arriba que no es complementaria a ninguno de

- 129 dichos ácidos nucleicos de VIH-l o VIH-2.

18. La composición de la reivindicación 17, en el que el primer y segundo cebador son cada uno de hasta 75 bases de longitud, y en el que el primer cebador consiste en el

5 Id. de Sec. Nº:13 que comprende opcionalmente la primera secuencia de cebador río arriba que no es complementaria a ninguno de dichos ácidos nucleicos de VIH-l o VIH-2.

19. La composición de la reivindicación 17, en el que el primer y segundo cebador son cada uno de hasta 75 bases

10 de longitud, y en el que el primer cebador consiste en el Id. de Sec. Nº:14 que comprende opcionalmente la primera secuencia de cebador río arriba que no es complementaria a ninguno de dichos ácidos nucleicos de VIH-l o VIH-2.

20. La composición de la reivindicación 17, en el que

15 el primer y segundo cebador son cada uno de hasta 75 bases de longitud, y en el que el primer cebador consiste en el Id. de Sec. Nº:15 que comprende opcionalmente la primera secuencia de cebador río arriba que no es complementaria a ninguno de dichos ácidos nucleicos de VIH-l o VIH-2.


 

Patentes similares o relacionadas:

Método para analizar ácido nucleico molde, método para analizar sustancia objetivo, kit de análisis para ácido nucleico molde o sustancia objetivo y analizador para ácido nucleico molde o sustancia objetivo, del 29 de Julio de 2020, de Kabushiki Kaisha DNAFORM: Un método para analizar un ácido nucleico molde, que comprende las etapas de: fraccionar una muestra que comprende un ácido nucleico molde […]

MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMOS ATÓPICOS SENSIBLES A COMPONENTES ALERGÉNICOS DEL POLEN DE OLEA EUROPAEA (OLIVO), del 23 de Julio de 2020, de SERVICIO ANDALUZ DE SALUD: Biomarcadores y método para el diagnostico, estratificación, seguimiento y pronostico de la evolución de la enfermedad alérgica a polen del olivo, kit […]

Detección de interacciones proteína a proteína, del 15 de Julio de 2020, de THE GOVERNING COUNCIL OF THE UNIVERSITY OF TORONTO: Un método para medir cuantitativamente la fuerza y la afinidad de una interacción entre una primera proteína de membrana o parte de la misma y una […]

Secuenciación dirigida y filtrado de UID, del 15 de Julio de 2020, de F. HOFFMANN-LA ROCHE AG: Un procedimiento para generar una biblioteca de polinucleótidos que comprende: (a) generar una primera secuencia del complemento (CS) de un polinucleótido diana a partir […]

Métodos para la recopilación, estabilización y conservación de muestras, del 8 de Julio de 2020, de Drawbridge Health, Inc: Un método para estabilizar uno o más componentes biológicos de una muestra biológica de un sujeto, comprendiendo el método obtener un […]

Evento de maíz DP-004114-3 y métodos para la detección del mismo, del 1 de Julio de 2020, de PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.: Un amplicón que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 32 o el complemento de longitud completa del mismo.

Composiciones para modular la expresión de SOD-1, del 24 de Junio de 2020, de Biogen MA Inc: Un compuesto antisentido según la siguiente fórmula: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te (secuencia […]

Aislamiento de ácidos nucleicos, del 24 de Junio de 2020, de REVOLUGEN LIMITED: Un método de aislamiento de ácidos nucleicos que comprenden ADN de material biológico, comprendiendo el método las etapas que consisten en: (i) efectuar un lisado […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .