Composiciones y métodos para la decoloración enzimática de clorofila.

Uso de al menos un polipéptido como se expone en SEC ID NO:10,

o de al menos un polipéptido que es una variante de SEC ID NO:10, y la variante es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a SEC ID NO:10, que tiene una actividad de clorofilasa, en un tratamiento enzimático que es una decoloración de una composición que contiene clorofila en condiciones en las que el polipéptido puede catalizar la hidrólisis de la clorofila para generar una clorofilida y un fitol; y la clorofilida y el fitol se separan.

Composiciones y métodos para la decoloración enzimática de clorofila

CAMPO TÉCNICO

Esta invención se refiere a los campos del procesamiento industrial de alimentos, piensos o aceites vegetales, productos vegetales y animales, y a enzimología. En particular, la invención proporciona composiciones y métodos para el tratamiento enzimático (“blanqueo” o “decoloración”) de composiciones que contienen clorofila o que están contaminadas con clorofila, por ejemplo preparaciones de algas, animales o vegetales, alimentos, piensos o aceites, por ejemplo aceites vegetales, incluyendo aceites procesados a partir de oleaginosas, tales como aceite de cánola (colza) o aceite de haba de soja, o frutos oleosos, tales como aceite de palma. En un aspecto, la invención proporciona métodos usando enzimas procedentes del catabolismo de la clorofila (por ejemplo, una clorofilasa) para la modificación enzimática de una clorofila, por ejemplo en una preparación de algas, animal o vegetal, o un alimento, un pienso o un aceite.

ANTECEDENTES

Los aceites vegetales que proceden de oleaginosas tales como cánola o haba de soja, o frutos oleaginosos tales como palma, contienen clorofila. La clorofila se elimina durante muchas etapas del procedimiento de producción de aceite, incluyendo etapas de trituración de las semillas, extracción del aceite, desgomado, tratamiento cáustico y blanqueo. En la última de éstas, la clorofila residual del procedimiento de blanqueo se elimina hasta lograr niveles aceptables. Esta clorofila se elimina típicamente del aceite en una etapa del procedimiento de blanqueo que implica calentar el aceite y hacerlo pasar a través de un adsorbente para eliminar la clorofila y otros compuestos que poseen color que afecta al aspecto y/o estabilidad del aceite acabado. Esta tecnología también se usa para tratar otros aceites o preparaciones vegetales o de algas que contienen clorofila, tales como aceites que contienen ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) (por ejemplo, ácido eicosapentenoico (EPA) y ácido docosahexenoico (DHA) ) .

Un nivel elevado de pigmentos de clorofila da un color indeseable e induce la oxidación del aceite durante el almacenamiento, conduciendo al deterioro del aceite. En la industria del procesamiento de aceites comestibles, se emplea una etapa de blanqueo para reducir los niveles de clorofila tan bajos como 0, 1 ppm para garantizar la calidad del aceite en términos de color y cualidad organoléptica. Los niveles de clorofila acabados deseados típicos están entre 0, 02 y 0, 05 ppm. Esta etapa de blanqueo incrementa el coste de procesamiento y reduce el rendimiento del aceite debido al arrastre en la arcilla de blanqueo.

En plantas, la clorofilasa (clasa) es la primera enzima implicada en la degradación de la clorofila; cataliza la hidrólisis de un enlace de éster en la clorofila para producir clorofilida y fitol.

La degradación de la clorofila en aceite de cánola con clorofilasa derivada del alga Phaeodactylum tricornutum es conocida desde Khamessan y Kermasha, J. Food Biochemistr y 1996 (20) , p. 311-328. La actividad de clorofilasa descrita aquí parece estar influida por la presencia de un tensioactivo, un disolvente orgánico y la concentración de aceite de cánola.

El documento WO 2005/032496 describe polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad de hidrolasa. El documento WO 2005/032496 no describe el uso de hidrolasas en la degradación de clorofila.

SUMARIO

La invención proporciona composiciones y métodos para el tratamiento enzimático (“blanqueo” o “decoloración”) de composiciones que contienen clorofila o que están contaminadas con clorofila, tales como preparaciones vegetales, animales (por ejemplo, preparaciones de pescado, de carne) o de algas, alimentos, piensos o aceites, tales como aceites que contienen ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) o que contienen ácido docosahexenoico (DHA) , o composiciones que comprenden mezclas de los mismos. El “blanqueo enzimático” de las composiciones y métodos de la invención comprende el uso de una enzima modificadora de la clorofila, por ejemplo un polipéptido que tiene actividad de clorofilasa, incluyendo clasas y clorofila clorofilido-hidrolasas, y péptidos relacionados, o cualquier

enzima catabólica de la clorofila. De este modo, como se usa aquí, la expresión “blanqueo enzimático” incluye cualquier modificación de una molécula de clorofila o equivalente, incluyendo la decoloración parcial o completa. Las composiciones y métodos de la invención pueden reducir la pérdida de rendimiento debido al arrastre y división de grasas atribuidos a la catálisis por condiciones de arcilla/blanqueo.

En los métodos y procedimientos de la invención, se añade en cualquier momento y en cualquier lugar en el método o procedimiento, por ejemplo como se discute aquí, una clorofilasa, que puede ser una nueva clorofilasa de la invención, o una enzima conocida, incluyendo clasas y clorofila clorofilido-hidrolasas y péptidos relacionados, o una combinación de los mismos, o cualquier enzima catabólica de la clorofila. Por ejemplo, la clorofilasa (que puede ser una nueva clorofilasa de la invención, o una enzima conocida, o una combinación de las mismas) y/o cualquier enzima catabólica de la clorofila se pueden añadir a una composición, tal como un aceite bruto, con o sin otra enzima, por ejemplo una fosfolipasa (por ejemplo, fosfolipasa C) , en una etapa de mezclamiento o en una etapa de desgomado, en una etapa de tanque cáustico, en una mezcladora estática, en un tanque de día o en una mezcladora de retención. Como alternativa, se describe un método o procedimiento en el que la clorofilasa (de la invención, o conocida) y/o cualquier enzima catabólica de la clorofila se pueden añadir en cualquier combinación de estas etapas, o en todas estas etapas.

La invención proporciona métodos o procedimientos para la modificación enzimática de clorofila para facilitar su eliminación de una composición, por ejemplo a través de un procedimiento de separación acuoso, como se ilustra en la página 1, Apéndice A, o un procedimiento de separación hidrófobo, o un procedimiento de separación por afinidad, y similar.

La invención proporciona métodos y procedimientos que comprenden la modificación enzimática (por ejemplo, catabolismo) de la clorofila, o compuestos equivalentes, en una composición (por ejemplo, un alimento, pienso, planta, animal, alga, etc.) , que comprende además eliminar componentes de esa composición (por ejemplo, compuestos no deseables en un producto acabado) , tal como clorofila residual (por ejemplo clorofila o compuestos equivalentes no modificados mediante una clorofilasa) , un plaguicida, un hidrocarburo aromático policíclico, etc. Los componentes indeseables, por ejemplo clorofila residual, plaguicidas, hidrocarburos aromáticos policíclicos, y similares, se pueden eliminar con cantidades significativamente menores de arcilla de blanqueo u otro adsorbente, tal como sílice o compuestos equivalentes.

Estos componentes de la composición se eliminan usando una arcilla de blanqueo, por ejemplo en una pluralidad de etapas usando arcilla de blanqueo, en el que los componentes de la composición se eliminan con cantidades significativamente menores de arcilla de blanqueo y/o al menos algún otro adsorbente (por ejemplo, una sílice) . Los niveles de clorofila finales están entre alrededor de 0, 02 ppm y 0, 05 ppm. En este procedimiento ejemplar, la etapa de blanqueo puede incrementar los costes del procesamiento y reducir los rendimientos del aceite debido al arrastre en la arcilla de blanqueo. Las composiciones y procedimientos como se describen aquí pueden reducir la pérdida de rendimiento por arrastre y división de grasas atribuida a la catálisis por condiciones de arcilla/blanqueo.

En un método (reacción) ilustrado ejemplar de la invención, una clorofilasa cataliza la hidrólisis de clorofila para generar clorofilida, que se extrae de forma acuosa, y fitol, que permanece en la fase oleosa. En otro método ejemplar, la feoforbida se puede eliminar de manera similar a la clorofilida. Se describen composiciones y métodos en los que un procedimiento de separación acuoso puede eliminar parcial o completamente la necesidad de agentes adsorbentes. Sin embargo, los métodos comprenden la extracción parcial o completa de la clorofilida o feoforbida soluble acuosa usando un procedimiento de extracción a base de sílice (por ejemplo, refinado con sílice libre de adsorbente o con poco adsorbente) . En un aspecto, la clorofilasa se inmoviliza sobre una sílice (que entonces adsorbe la clorofilida) , por ejemplo un gel de sílice. La sílice puede comprender... [Seguir leyendo]

1. Uso de al menos un polipéptido como se expone en SEC ID NO:10, o de al menos un polipéptido que es una variante de SEC ID NO:10, y la variante es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a SEC ID NO:10, que tiene una actividad de clorofilasa, en un tratamiento enzimático que es una decoloración de una composición que contiene clorofila en condiciones en las que el polipéptido puede catalizar la hidrólisis de la clorofila para generar una clorofilida y un fitol; y la clorofilida y el fitol se separan.

2. Uso de al menos un polipéptido como se expone en SEC ID NO:10, o de al menos un polipéptido que es una variante de SEC ID NO:10, y la variante es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a SEC ID NO:10, que tiene una actividad de clorofilasa, en un tratamiento enzimático que es una decoloración de una composición que contiene feofitina en condiciones en las que el polipéptido puede catalizar la hidrólisis de la feofitina para generar una feoforbida y un fitol; y la feoforbida y el fitol se separan.

3. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el polipéptido se inmoviliza en: una matriz, una célula, un metal, una resina, un polímero, un material cerámico, un vidrio, un microelectrodo, una partícula grafítica, una perla, un gel, una placa, un tubo capilar, un soporte inorgánico o soporte orgánico, y opcionalmente el soporte comprende: una alúmina, celite, Dowex-1-cloruro, perlas de vidrio, sílice, gel de sílice, hidrogel de alginato, o perla de alginato.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición que contiene clorofila o feofitina:

(a) deriva de una planta, un animal o un alga, o una mezcla de los mismos,

(b) comprende un material vegetal, aceite vegetal o extracto vegetal,

(c) comprende un aceite vegetal o un aceite de semillas,

(d) comprende un aceite de palma o un aceite de cánola,

(e) comprende un aceite bruto o un aceite refinado,

(f) comprende una preparación de aceite bruto sin diluir, o

(g) comprende una preparación de algas.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que al menos una etapa del tratamiento se lleva a cabo en una vasija de reacción, y opcionalmente la vasija de reacción comprende un dispositivo de separación de goma gravitacional o un tanque de retención.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que al menos una etapa del tratamiento se lleva a cabo en un extracto celular o en una célula completa.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido se usa con una lipoxigenasa.

8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el tratamiento comprende además modificar el pH para promover la separación acuosa de una clorofilida o feoforbida.

9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el tratamiento se combina con una etapa de neutralización cáustica.

10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se usa polipéptido con una fosfolipasa, y opcionalmente la fosfolipasa es una fosfolipasa C.

11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el tratamiento está incluido en un procedimiento de desgomado.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el tratamiento comprende además la eliminación de clorofila o feofitina residual; plaguicidas; o hidrocarburos aromáticos policíclicos.

13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el polipéptido es codificado por un ácido nucleico como se expone en SEC ID NO:9.

14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el tratamiento enzimático de una composición que contiene clorofila o feofitina se combina con un procedimiento de desgomado y una etapa de neutralización cáustica.

15. El uso del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el polipéptido es codificado por una variante del ácido nucleico como se expone en SEC ID NO:9, y la variante es al menos 90%, 91%, 92%, 93%. 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a SEC ID NO:9.