Composiciones estabilizadas para factor VIII producido de manera recombinante.

Composición libre de histidina que comprende:

un factor VIII o factor r VIII de alta pureza;

arginina y sacarosa;

un agente tensoactivo para prevenir o al menos inhibir la adsorción superficial de factor VIII;

una cantidad de cloruro de calcio para la estabilización específica del factor VIII.

Composiciones estabilizadas para factor VIII producido de manera recombinante.

La presente invención se refiere a formulaciones liofilizadas con capacidad para proteger el factor VIII (factor-r VIII) , producido de manera recombinante, de alta pureza. La invención se refiere también a formulaciones líquidas del factor-r VIII antes de la liofilización y después de la reconstitución de la formulación sólida liofilizada a un líquido inyectable.

El factor VIII es una proteína esencial del plasma sanguíneo, implicada en el proceso de coagulación de la sangre. Un déficit de este factor de coagulación resulta en hemofilia A, una enfermedad potencialmente mortal que debe ser tratada mediante una terapia de reemplazo de factor VIII. Tradicionalmente, se han usado concentrados de factor VIII (factor-p VIII) purificado, derivado de plasma, para una terapia de reemplazo. Más recientemente, se dispone del factor VIII (factor-r VIII) , producido de manera recombinante, que proporciona un suministro independientemente de la donación de plasma, reduciendo el riesgo de enfermedades transmitidas por virus.

El factor VIII es una molécula compleja y una proteína muy sensible, asociada con la pérdida de actividad con el tiempo. En la sangre, otras proteínas sanguíneas, tales como albúmina de suero humano (HSA) y el factor de von Willebrand (vWF) ayudan a preservar la actividad coagulante del factor VIII. Sin embargo, es deseable evitar la presencia de proteínas obtenidas mediante purificación de plasma sanguíneo en las formulaciones farmacéuticas del factor-r VIII, debido al riesgo de transmisión del virus. De esta manera, es esencial proporcionar composiciones de otros excipientes farmacéuticamente aceptables para proteger el factor-r VIII contra la degradación física y química y la acumulación, que causan pérdida de actividad. Una técnica, usada comúnmente para prevenir la pérdida de actividad de la proteína durante un almacenamiento a largo plazo, es preparar formulaciones farmacéuticas sólidas secas mediante liofilización (secado por congelación) . Los excipientes farmacéuticos deben proteger también el factor VIII durante el procedimiento farmacéutico, durante un almacenamiento a largo plazo y después de la reconstitución de la formulación liofilizada a una solución para su administración.

La secuencia de ADN del factor VIII se divide en seis dominios; tres dominios A, dos dominios C y un dominio B, y la proteína contiene sitios de interacción para otros factores de coagulación, vWF, fosfolípidos e iones metálicos. La forma activa más pequeña de la proteína del factor VIII carece del dominio B y está compuesta de una cadena ligera de 80 kDa, asociada con una cadena pesada de 90 kDa (Wang W. et al, 2003) . Los productos farmacéuticos de factor-r VIII, tanto de longitud completa (Kogenate®, Bayer, Helixate®, CSL Behring, Recombinate®, Baxter y Advate®, Baxter) como con dominio B eliminado (ReFacto®, Wyeth y Xyntha®, Wyeth) , se comercializan en la actualidad.

En una formulación farmacéutica del factor VIII, todos los componentes deben ser seleccionados cuidadosamente. Cada excipiente proporciona una función protectora para mantener un alto rendimiento del factor VIII a lo largo de todo el procedimiento farmacéutico, el almacenamiento a largo plazo y, finalmente, la reconstitución y la administración al paciente. Además, se considera la seguridad clínica de todos los excipientes.

El propósito de la liofilización (Manning, MC et al, 1989, Tang, X. et al, 2004, Schwegman, J. J. et al, 2005) es eliminar el agua de la formulación, ya que, frecuentemente, se producen reacciones físicas y químicas adversas en la fase acuosa.

Se requieren crio/lioprotectores para proteger la proteína durante el procedimiento de liofilización y durante el almacenamiento, formando una matriz amoría que rodea la proteína.

Se incluye un agente de carga para que funcione como un elemento formador de torta para proporcionar un soporte mecánico durante la liofilización y para aumentar el peso en seco del producto farmacéutico. De esta manera, el agente de carga contribuye a proporcionar una calidad uniforme y la apariencia de un producto liofilizado.

Puede añadirse un agente tampón para mantener el pH a un valor adecuado para la proteína y para el uso terapéutico del producto.

Debido a la alta potencia del factor VIII, la concentración de factor VIII en soluciones terapéuticas es baja. Además, el factor VIII se absorbe fácilmente en las superficies, lo que convierte la absorción superficial en una fuente principal de pérdida de actividad durante la fabricación y después de la reconstitución del producto. Para los productos de factor VIII, comercializados en la actualidad, se afirma, normalmente, que un agente tensoactivo es usado por encima de su concentración micelar crítica (cmc) , que es la concentración de la solución a la que el agente tensoactivo forma agregados micelares. Los valores cmc de los detergentes no iónicos, que contienen polioxietileno, son dependientes de la temperatura, en el sentido de que el valor cmc se hace mayor a temperaturas más bajas (Alexandridis, P. et al, 1994, Nilsson, M. et al, 2007) . El valor cmc de Poloxamer 188 es al menos de 20-30 mg/ml a 37ºC (Kabanov, A.V. et al, 1995, Alexandridis, P. et al, 1994, Moghimi, S.M. et al, 2004) y aumenta a 100 mg/ml a 20ºC (Nakashima, K. et al, 1994) . De esta manera, según estos informes, el valor cmc de Poloxamer 188 se encuentra dentro del intervalo de 20-100 mg/ml a 25ºC.

Se ha demostrado que los iones metálicos están implicados en la asociación de las cadenas ligera y pesada del factor VIII (Wang W et al, 2003) y, por lo tanto, los iones de calcio (Ca2+) están presentes, normalmente, en las formulaciones de factor VIII, para mantener la asociación del complejo de las cadenas de 80 y 90 kDa.

Se han realizado considerables esfuerzos para encontrar formulaciones de factor VIII adecuadas, por ejemplo:

Una publicación de Österberg et al (1997) describe una formulación que comprende cloruro de sodio como agente de carga, en combinación con un tensoactivo, cloruro de calcio y sacarosa como estabilizador e histidina como agente tampón.

El documento US-B-7247707 (Besman et al) divulga formulaciones libres de albúmina que comprenden de 300 a 500 mM de cloruro sódico, del 1 al 4% de un estabilizador seleccionado entre el grupo consistente en sacarosa, trehalosa, rafinosa y arginina, de 1 a 5 mM de CaCl2, y un agente tampón, preferentemente histidina. Se incluye también un tensoactivo en la composición, en una concentración de hasta el 0, 1%.

El documento US-A-5874408 (Nayar) describe una formulación de factor VIII recombinante, que comprende glicina, histidina, sacarosa, CaCl2 y pequeñas cantidades de cloruro de sodio. Nayar descubrió que la histidina, que se incluye como agente tampón en todas las preparaciones de factor-r VIII, disponibles comercialmente en la actualidad, tenía un efecto desestabilizador en las formulaciones liofilizadas de factor VIII. Sin embargo, este efecto fue superado mediante la adición de sales, glicina y sacarosa.

El documento US-A-4877608 (Lee et al) describe el uso de una formulación proteínica de factor VIII, altamente purificada, en una solución acuosa que consiste, esencialmente, en factor VIII terapéuticamente activo, con una actividad de al menos 130 IU/mg; de 0, 4 a 1, 2 M de cloruro de sodio, cloruro de potasio o sus mezclas; de 1, 5 a 40 mM de cloruro de calcio y de 1 a 50 mM de histidina y, opcionalmente hasta el 10% de un azúcar seleccionado de entre el grupo que consiste en manitol, sacarosa y maltosa.

El documento US-A-2005/0256038 (White et al) enseña una composición liofilizada de factor VIII, que comprende un agente tensoactivo, cloruro de calcio, sacarosa, cloruro de sodio, citrato de trisodio y un tampón sin aminoácidos.

El documento WO-A-99/10011 (Kanellos et al) divulga formulaciones tratadas térmicamente para factor VIII de plasma, con alta pureza. La formulación comprende una cantidad estabilizante efectiva de sacarosa, trehalosa y al menos un aminoácido. El aminoácido preferente es lisina, pero otros que pueden ser usados son isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, alanina, arginina, histidina, prolina, serina y glicina.

El documento EP-A-1016673 (Österberg et al) enseña el uso de formulaciones que comprenden un tensoactivo no iónico como un estabilizador y factor VIII que tiene una actividad... [Seguir leyendo]

1. Composición libre de histidina que comprende: un factor VIII o factor r VIII de alta pureza; arginina y sacarosa; un agente tensoactivo para prevenir o al menos inhibir la adsorción superficial de factor VIII; una cantidad de cloruro de calcio para la estabilización específica del factor VIII.

2. Composición libre de histidina según la reivindicación 1, en la que el cloruro de sodio está presente como agente de carga si la arginina y la sacarosa trabajan como crio/lioprotector pero no como agente de carga.

3. Composición libre de histidina según la reivindicación 1, en la que, esencialmente, no hay cloruro de sodio presente, en particular si la arginina es usada como crio/lioprotector y agente de carga.

4. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el factor r VIII es un derivado de supresión del factor VIII nativo, que carece, parcial o completamente, del dominio B del factor VIII nativo.

5. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en forma liofilizada.

6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en forma de una solución a ser liofilizada o en forma de una solución reconstituida preparada a partir de una composición liofilizada y diluyente.

7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2, y 4 a 6, que comprende como crio/lioprotector 3-15 mg/ml de sacarosa y 3-15 mg/ml de arginina, con la condición de que estén presentes al menos 6 mg/ml de crio/lioprotector, y como agente de carga de 10 mg/ml a 40 mg/ml de cloruro de sodio.

8. Composición según la reivindicación 7, en la que el crio/lioprotector incluye tanto arginina como sacarosa, en particular, de 3 mg/ml a 10 mg/ml, particularmente de 4, 5 mg/ml a 9 mg/ml de sacarosa, de 3 mg/ml a 8 mg/ml, particularmente de 4, 5 mg/ml a 6, 8 mg/ml de arginina y de 10 a 40 mg/ml de NaCl, en particular de 15 mg/ml a 23 mg/ml de cloruro de sodio.

9. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que la sacarosa está presente en una cantidad de 10 mg/ml a 25 mg/ml y el cloruro de sodio está presente en una cantidad de 10 mg/ml a 40 mg/ml.

10. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, que comprende un crio/lioprotector que es sacarosa y un agente de carga que es arginina, en particular de 5 mg/ml a 25 mg/ml de sacarosa y de 20 mg/ml a 70 mg/ml de arginina.

11. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que la arginina funciona tanto como agente de carga como crio/lioprotector, en particular en una cantidad de 20 mg/ml a 70 mg/ml.

12. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el agente tensoactivo es una proteína, en particular una proteína recombinante, tal como albúmina producida de manera recombinante, en particular en una cantidad de 0, 5 mg/ml a 5 mg/ml.

13. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el agente tensoactivo es un tensoactivo no iónico, en particular en una concentración por debajo de la concentración micelar crítica.

14. Composición según la reivindicación 13, en la que el tensoactivo no iónico es un copolímero de polioxietilenopolioxipropileno, en particular en una concentración de 0, 1 mg/ml a 5 mg/ml.

15. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la actividad específica del factor r VIII es

5.000 IU/mg de proteína.