CEPAS DE S. CEREVISIAE CAPACES DE CRECER EN MEDIOS CON MELIBIOSA, ESTAQUIOSA Y RAFINOSA.

La invención se relaciona con cepas de S. cerevisiae capaces de secretar alfa-galactosidasa al medio de cultivo

, así como a métodos para la obtención de alfa-galactosidasa utilizando dichas cepas y métodos para la producción de biomasa y bioetanol mediante el cultivo de dichas cepas en medios ricos en galactosa. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para la expresión de proteínas recombinantes usando una composición rica en galactosa como medio de cultivo para los microorganismos productores de dicha proteína.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200900961.

Solicitante: UNIVERSIDADE DA CORUÑA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: A CORUÑA.

Inventor/es: GONZALEZ SISO, MARIA ISABEL, BECERRA FERNANDEZ, MANUEL, CERDAN VILLANUEVA,MARIA ESPERANZA, PEREIRA RODRIGUEZ,ANGEL, FERNANDEZ LEIRO,RAFAEL.

Fecha de Solicitud: 8 de Abril de 2009.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 21 de Diciembre de 2011.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/81 (para levaduras)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/40 (actúan sobre los enlaces alfa-galactosa-glicósido, p. ej. alfa-galactosidasa)

Clasificación PCT:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/42 (actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/81 (para levaduras)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/40 (actúan sobre los enlaces alfa-galactosa-glicósido, p. ej. alfa-galactosidasa)

PDF original: ES-2351296_A1.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Cepas de S. cerevisiae capaces de crecer en medios con melibiosa, estaquiosa y rafinosa.

Campo de la invención

La invención se relaciona con cepas de S. cerevisiae que son capaces de producir α-galactosidasa. Para su mejor secreción, el gen de la α-galactosidasa tiene fusionada una secuencia señal. Dichas cepas son útiles en métodos para la producción de α-galactosidasa, de biomasa y de etanol, a partir de un medio rico en rafinosa, melibiosa y/o estaquiosa y, en el caso de que las cepas contengan una segunda construcción que exprese una proteína de interés terapéutica, para la producción de dichas proteínas terapéuticas.

Antecedentes de la invención

Las α-galactosidasas (EC 3.2.1.22) catalizan la hidrólisis de residuos de galactosa unidos por enlaces α(1,6) de galacto-oligosacáridos y galacto-mananos poliméricos (polímeros de mañosas con ramificaciones de galactosa), así como la de oligosacáridos como la estaquiosa, rafinosa y melibiosa presentes en habas, soja y otras legumbres.

Estas enzimas están ampliamente distribuidas en animales, plantas y microorganismos. Sin embargo, la mayoría de los mamíferos monogástricos, incluidos los humanos, carecen de α-galactosidasa pancreática, de manera que este tipo de oligosacáridos no pueden ser digeridos en el sistema digestivo y son fermentados por la microflora intestinal produciendo gases que generan flatulencia y otro tipo de desórdenes gastrointestinales que pueden causar problemas de diferente consideración en individuos sensibles. El caso de la soja y los productos derivados de ésta tiene especial importancia pues son un componente importante en la dieta de muchas personas, puesto que constituye una buena fuente de proteínas y se utiliza en algunos casos como sustituto de productos lácteos, por ejemplo en personas con intolerancia a la lactosa. Para el tratamiento de estos desórdenes existen suplementos alimentarios consistentes en concentrados de α-galactosidasa de diferentes orígenes (Lactococus, Aspergillus niger, Saccharomyces, etc.) como por ejemplo los comprimidos fabricados por Promefarm (Sinaire). El pretratamiento con α-galactosidasa de estos productos de la soja, así como de otros preparados para nutrición humana y animal con contenido elevado en oligosacáridos no digeribles como la rafinosa y la estaquiosa, constituye una buena alternativa para evitar estos problemas gastrointestinales. Además contribuye al aumento del valor nutricional de los mismos; este punto tiene gran importancia en nutrición animal puesto que se aumenta el aprovechamiento energético de los piensos.

En humanos, la α-galactosidasa es una exoglicosidasa lisosómica que actúa sobre residuos terminales de tipo α-galactosil de glicolípidos y glicoproteínas. Mutaciones en este gen provocan deficiencias en estas degradaciones que resultan en la enfermedad de Fabry (esfingolipodisis ligada al cromosoma X). Esta enfermedad presenta una incidencia de 1/40.000. En la actualidad existen tratamientos, como el desarrollado por la empresa Genzyme Corp. (Fabrazyme), basado en la técnica de reemplazamiento enzimático para tratar esta enfermedad mediante la utilización de α-galactosidasa de humanos expresada en ratones CHO. Como alternativa más rentable a la utilización de células de mamíferos para la producción heteróloga de la proteína, se ha estudiado la utilización de α-galactosidasa humana expresada de forma recombinante en levaduras.

Por otro lado, el cáliz glicoproteico de la superficie celular de glóbulos rojos determina, entre otras muchas funciones, el tipo sanguíneo de cada individuo. La sangre de tipo 0 puede ser empleada para realizar transfusiones a cualquier individuo por lo que es la más necesaria. Empleando α-galactosidasas capaces de procesar enlaces de galactosa de tipo α (1-3) se puede imitar el tipo sanguíneo 0 a partir de sangre de tipo B.

En la producción de caramelo y de azúcar a nivel industrial también se utiliza la α-galactosidasa para eliminar la presencia de rafinosa que impide la correcta cristalización del caramelo y mejorar así la producción. Además, el producto de desecho de esta industria, las melazas, tiene un elevado contenido en rafinosa y estaquiosa, que hace que no pueda ser vertido de forma directa al tener una elevada biodegradabilidad (DBO). Esta enzima u organismos productores de la misma son empleados para degradar estos azúcares y acoplar esta degradación a otra función como puede ser la producción de etanol o de biomasa. Las melazas, además, son el sustrato más utilizado para la producción de las cerca de 430000 toneladas de S. cerevisiae para panificación (peso seco) que se producen anualmente. Las cepas de levaduras empleadas en panificación carecen de α-galactosidasa y se han desarrollado cepas de Saccharomyces de panificación con el gen que codifica para la α-galactosidasa de S. cerevisiae var. uvarum con el fin de mejorar la producción de esta biomasa (Liljeström-Suominen et al.; Appl Environ Microbiol. 1988 Jan;54(1):245-249).

En el caso de levaduras, se ha descrito que la α-galactosidasa libera los residuos no reductores en posición terminal de galactosa situados en extremos terminales de los sustratos pero no los residuos internos (). Además de la actividad hidrolítica, las α-galactosidasas poseen la capacidad de sintetizar oligosacáridos por transglicosilación y por hidrólisis inversa en presencia de concentraciones elevadas de monosacáridos (). Saccharomyces cerevisiae es una de las fuentes de α-galactosidasa más estudiada y su utilización en aplicaciones biotecnológicas está ampliamente extendida ().

Dada la importancia y las amplias aplicaciones biotecnológicas de esta enzima, existen datos acerca de la producción de α-galactosidasa a partir de bacterias como Bacillus stearothermophilus (patente US nº 3846239), Thermus sp. cepa T2 (patente ES nº 2172380), Streptomyces griseoloalbus (Anisha et al.; Appl Biochem Biotechnol. 2008 Sep 4), sin embargo, y dado que muchas de las aplicaciones que va a tener esta enzima van a estar relacionados con el procesamiento o la preparación de materiales relacionados con la alimentación bien animal o bien humana, es esencial que el microorganismo que se vaya a utilizar sea GRAS (General Recognised As Safe), como es el caso de S, cerevisiae. También existen datos de la producción de α-galactosidasa a partir de cepas de hongos de los géneros Neurospora y Rhizopus (Worthington y Beuchat, J Agrie Food Chem. 1974; 22(6): 1063-6), Aspergillus oryzae, A. foetidus (Liu et al., Lett Appl Microbiol. 2007 Aug;45(2):206-12), A. ficuum (Zapater et al., Prep Biochem. 1990;20(3-4):263-96) y A. niger entre otros (patentes US nº 6197566 y nº 5919690) aunque uno de los principales inconvenientes de la producción en hongos es la producción de productos secundarios no deseados. En el caso de la producción de α-galactosidasa en A. niger se producen cantidades importantes de ácido oxálico. Asimismo, existen datos de producción de α-galactosidasa no humana, como la de la planta guar (Cyamopsis tetragonoloba) fusionada a diferentes secuencias señal (Harmsen, M. et al., Gene. 1993 Mar 30; 125(2):115-23).

En cuanto a la producción en levaduras, la patente US 4431737 describe una cepa mutada de S. cerevisiae productora de α-galactosidasa obtenida por mutagénesis mediante radiaciones ultravioleta. El inconveniente de las cepas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Construcción de ADN que comprende:

(a) un promotor heterólogo regulado mediante represión por glucosa,

(b) una secuencia que codifica una secuencia señal funcional en levadura, y

(c) la región del gen MEL1 que codifica la forma madura de α-galactosidasa o una variante funcionalmente equivalente

en donde las secuencias (b) y (c) han de estar bajo el mismo marco de lectura.

2. Construcción según la reivindicación 1, en la que el promotor heterólogo regulado mediante represión por glucosa sería el promotor ADH2.

3. Construcción según la reivindicación 1, en la que la secuencia señal es la secuencia señal endógena del gen MEL1.

4. Construcción según la reivindicación 1, en la que la secuencia señal es la secuencia señal del factor a de levadura.

5. Construcción de ADN que comprende:

(a) el promotor ADH2 o una variante funcionalmente equivalente del mismo,

(b) una secuencia que codifica una secuencia señal funcional en levadura, y

(c) la región de un gen que codifica una forma madura de α-galactosidasa o una variante funcionalmente equivalente,

en donde las secuencias (b) y (c) han de estar bajo el mismo marco de lectura.

6. Construcción según la reivindicación 5, en la que el gen que codifica la proteína α-galactosidasa sería el gen MEL1.

7. Construcción según la reivindicación 5, en la que la secuencia señal es la secuencia señal endógena del gen MEL1.

8. Construcción según la reivindicación 5, en la que la secuencia señal es la secuencia señal del factor α de levadura.

9. Proteína codificada por las construcciones según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Vector de expresión que contiene la construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Un microorganismo que contiene el vector según la reivindicación 10, la construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la proteína según la reivindicación 9.

12. Microorganismo según la reivindicación 11, en la que el microorganismo es una levadura.

13. Microorganismo según la reivindicación 12, en la que el microorganismo es Saccharomyces cerevisiae.

14. Un método para producir α-galactosidasa que comprende las etapas de (a) cultivar un microorganismo según las reivindicaciones 11, 12 ó 13, en un sustrato que contenga residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal, y (b) recuperar la α-galactosidasa secretada del medio de cultivo.

15. Método según la reivindicación 14, en el que el sustrato que contiene residuos de α-D-galactosa no reductores en posición terminal se selecciona del grupo de rafinosa, melibiosa, estaquiosa, melazas de caña de azúcar y/o remolacha, permeados de proteína de soja y una combinación de cualquiera de los anteriores.