Células en polvo seco y reactivos de cultivo celular y métodos para la producción de estos.

Un medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos que soportan el cultivo de una célula in vitro que comprende partículas de aproximadamente 1-100 mesh de tamaño,

y que comprenden vitaminas y aminoácidos.

Células en polvo seco y reactivos de cultivo celular y métodos para la producción de estos 5

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La descripción se refiere generalmente a formulaciones de células, medios nutritivos, suplementos de medios, subgrupos de medios y amortiguadores. Específicamente, la presente invención proporciona formulaciones de medio nutritivo en polvo seco, particularmente formulaciones de medio de cultivo celular, que comprenden todos los factores 10 nutritivos necesarios que facilitan el cultivo in vitro de células, y los métodos de producción de estas formulaciones de medios. La invención se refiere además a métodos para producir suplementos de medios en polvo seco, tales como sueros en polvo seco (por ejemplo, suero fetal bovino) . La invención se refiere además a formulaciones de amortiguador en polvo seco que producen condiciones iónicas y de pH particulares tras la rehidratación. La descripción se refiere además a métodos para producir células en polvo seco, tales como células procariotas (por ejemplo, bacterianas) y 15 eucariotas (por ejemplo, fúngicas (especialmente de levadura) , animales (especialmente de mamífero) y vegetales) . La descripción se refiere a métodos para preparar formulaciones de medios nutritivos, suplementos de medios (particularmente sueros en polvo seco) , subgrupos de medios y amortiguadores en polvo seco estériles. La invención se refiere además a formulaciones de medios nutritivos, suplementos de medios, subgrupos de medios y de amortiguadores en polvo seco preparados mediante estos métodos. La presente invención se refiere además a 20 estuches y métodos para el cultivo de células procariotas y eucariotas mediante el uso de estas formulaciones de medios nutritivos, suplementos de medios, subgrupos de medios y amortiguadores en polvo seco.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Medios de cultivo celular

Los medios de cultivo celular proporcionan los nutrientes necesarios para mantener y cultivar las células en un medio ambiente controlado, artificial e in vitro. Las características y las composiciones de los medios de cultivo celular varían en dependencia de los requerimientos celulares particulares. Los parámetros importantes incluyen osmolalidad, pH, y 30 formulaciones de nutrientes.

Las formulaciones de medios se han usado para cultivar una serie de tipos celulares que incluyen células animales, vegetales y bacterianas. Las células cultivadas en medios de cultivo catabolizan los nutrientes disponibles y producen sustancias biológicas útiles tales como anticuerpos monoclonales, hormonas, factores de crecimiento, virus y similares. 35 Tales productos tienen aplicaciones terapéuticas y, con el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante, las células pueden modificarse mediante ingeniería genética para producir grandes cantidades de estos productos. Por lo tanto, la capacidad de cultivar células in vitro no solo es importante para el estudio de la fisiología celular, sino que además es necesaria para la producción de sustancias útiles que no pueden obtenerse de cualquier otra manera por medios rentables. 40

Las formulaciones de medios de cultivo celular están bien documentadas en la literatura y una serie de medios está disponible comercialmente. A inicios del trabajo en el cultivo celular, las formulaciones de medios se basaban en la composición química y en las propiedades físico-químicas de la sangre (por ejemplo, osmolalidad, pH, etc.) y se denominaban "soluciones fisiológicas" (Ringer, S., J. Physiol., 3:380-393 (1880) ; Waymouth, C., En: Cells and Tissues in 45 Culture, Vol. 1, Academic Press, Londres, págs. 99-142 (1965) ; Waymouth, C., In Vitro 6:109-127 (1970) ) . Sin embargo, las células en diferentes tejidos del cuerpo de los mamíferos están expuestas a microambientes diferentes con respecto a la presión parcial de oxígeno/dióxido de carbono y las concentraciones de nutrientes, vitaminas, y elementos traza; en consecuencia, el cultivo in vitro exitoso de diferentes tipos celulares frecuentemente requerirá el uso de diferentes formulaciones de medios. Los componentes típicos de los medios de cultivo celular incluyen aminoácidos, sales 50 orgánicas e inorgánicas, vitaminas, metales traza, azúcares, lípidos y ácidos nucleicos, cuyos tipos y cantidades pueden variar en dependencia de los requerimientos particulares de un tipo de célula o de tejido dado. Frecuentemente, particularmente en composiciones de medios complejos, los problemas de estabilidad resultan en productos tóxicos y/o concentraciones eficaces más bajas de los nutrientes requeridos, lo que limita de esta manera la vida útil funcional de los medios de cultivo. Por ejemplo, la glutamina es un constituyente de casi todos los medios que se usan en el cultivo 55 in vitro de células de mamífero. La glutamina se descompone espontáneamente en ácido pirrolidonacarboxílico y amoniaco. La velocidad de degradación puede estar influenciada por las condiciones iónicas y el pH pero en los medios de cultivo celular, la formación de estos productos de descomposición frecuentemente no puede evitarse (Tritsch y otros, Exp. Cell Res. 28:360-364 (1962) )

60 Wang y otros (In Vitro 14 (8) :715-722 (1978) ) han demostrado que los fotoproductos tales como el peróxido de hidrógeno, que son letales para las células, se producen en el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) . La riboflavina y el triptofano o la tirosina son componentes necesarios para la formación del peróxido de hidrógeno durante la exposición a la luz. Dado que la mayoría de los medios de cultivo de mamífero contienen riboflavina, tirosina y triptofano, los fotoproductos tóxicos deben producirse en la mayoría de los medios de cultivo celular.

Para evitar estos problemas, los investigadores prepararan los medios sobre una base "según sea necesario", y evitan 5 el almacenamiento a largo plazo de los medios de cultivo. Los medios disponibles comercialmente, típicamente en forma de polvo seco, sirven como una alternativa conveniente para hacer los medios a partir de cero, es decir, adicionando cada nutriente de forma individual, y además evitan algunos de los problemas de estabilidad asociados con los medios líquidos. Sin embargo, están disponibles sólo una serie limitada de medios de cultivo comerciales, excepto por aquellas formulaciones personalizadas suministradas por el fabricante. 10

Aunque las formulaciones de medios en polvo seco pueden aumentar la vida en estante de algunos medios, existe una serie de problemas asociados con los medios en polvo seco, especialmente en aplicaciones a gran escala. La producción de grandes volúmenes de medios requiere instalaciones de almacenamiento para los medios en polvo seco, sin mencionar las cocinas de medios especializadas necesarias para mezclar y pesar los componentes nutrientes. 15 Debido a la naturaleza corrosiva de los medios en polvo seco, los tanques de mezclado deben reemplazarse periódicamente.

Típicamente, las formulaciones de medios de cultivo celular están suplementadas con una variedad de aditivos, que incluyen componentes indefinidos tales como suero fetal bovino (FBS) (10-20% v/v) o extractos de embriones, órganos 20 o glándulas de animales (0.5-10% v/v) . Si bien el FBS es el suplemento más comúnmente aplicado en los medios de cultivo de células animales, de forma rutinaria se usan además otras fuentes de suero, que incluyen ternero recién nacido, caballo y humano. Los órganos o glándulas que se han usado para preparar extractos para la suplementación de medios de cultivo incluyen la glándula submaxilar (Cohen, S., J. Biol. Chem. 237:1555-1565 (1961) ) , la pituitaria (Peehl, D.M., y Ham, R.G., In Vitro 16:516-525 (1980) ; patente de los Estados Unidos núm. 4, 673, 649) , el hipotálamo 25 (Maciag, T., y otros, Proc. Natl. Acad Sci. USA 76:5674-5678 (1979) ; Gilchrest, B.A, y otros, J Cell Physiol. 120:377-383 (1984) ) , retina ocular (Barretault, D., y otros, Differentiation 18:29-42 (1981) ) y cerebro (Maciag, T., y otros, Science 211:1452-1454 (1981) ) . Estos tipos de suplementos químicamente indefinidos cumplen varias funciones útiles en los medios de cultivo celular (Lambert, K.J. y otros, En: Animal Cell Biotechnology, Vol. 1. Spier, R.E. y otros, Eds.., Academic Press Nueva York, págs, 85-122 (1985) ) . Por ejemplo, estos suplementos proporcionan vehículos o quelantes 30 para los nutrientes lábiles o insolubles en agua; unen y neutralizan porciones tóxicas; proporcionan hormonas y factores de crecimiento, inhibidores de proteasa y nutrientes esenciales de bajo peso molecular, frecuentemente indefinidos o sin identificar; y protegen a las células del estrés físico y de daños. Por lo tanto, el suero o los extractos de órgano/glándula se usan comúnmente como suplementos de costo... [Seguir leyendo]

1. Un medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos que soportan el cultivo de una célula in vitro que comprende partículas de aproximadamente 1-100 mesh de tamaño, y que comprenden vitaminas y aminoácidos. 5

2. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de la reivindicación 1 en donde las partículas son de aproximadamente 2-50 mesh.

3. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de la reivindicación 1, en donde las partículas son de aproximadament.

5. 100 mesh.

4. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho 15 fluidizado o combinación de estos de cualquier reivindicación precedente, en donde los aminoácidos son L-glutamina y cistina.

5. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de cualquier reivindicación precedente que se obtiene mediante un método 20 que comprende la etapa de secar el medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado o combinación de estos a una temperatura d.

5. 80º C.

6. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de cualquier reivindicación precedente, que se obtiene mediante un método 25 que comprende:

(a) colocar un medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo o combinación de estos en un aparato de lecho fluidizado;

(b) someter dicho medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo o 30 combinación de estos en una columna de movimiento ascendente de un gas;

(c) pasar dicho medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo o combinación de estos a través de un filtro, en donde el filtro es un tamiz de malla;

(d) inyectar una cantidad controlada y definida de un líquido en la corriente del medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo o combinación de estos para producir 35 un estado húmedo; y (e) secar el producto de la etapa (d) para producir un medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado o combinación de estos.

7. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho 40 fluidizado o combinación de estos de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde los componentes individuales se mezclan previo al proceso de aglomeración para resultar en un medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado de un solo componente.

8. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho 45 fluidizado o combinación de estos de la reivindicación 6, que tiene un tamaño de partícula más grande en comparación con el medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo o combinación de estos de la etapa (a) .

9. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho 50 fluidizado o combinación de estos de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el filtro es un tamiz de malla de aproximadamente 3.5 - 15 mesh.

10. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el filtro es un tamiz de 55 malla de aproximadamente 4 a 6 mesh.

11. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de cualquier reivindicación precedente que es un polvo de medio de cultivo celular eucariótico. 60

12. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de cualquiera de las reivindicaciones precedentes adicionales que comprenden:

(i) una o más sales amortiguadoras; y 5

(ii) un ácido o base,

en donde el medio, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador o combinación de estos es adecuado para la reconstitución que se realiza en una etapa y resulta en un medio, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador con ajuste automático de pH o combinación de estos. 10

13. Usar el medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de cualquier reivindicación precedente para el cultivo de células en donde el medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo o combinación se reconstituye en un disolvente previo a contactar las células. 15

14. Un estuche que comprende el medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. El estuche de la reivindicación 14 que comprende además uno o más envases. 20

16. Un medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos que comprenden partículas de aproximadamente 1-100 mesh que soporta el cultivo de una célula in vitro, que comprende vitaminas y aminoácidos, que se disuelve rápidamente para producir una solución con ajuste de pH automático tras la reconstitución, y que es opcionalmente un medio, 25 suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador de un solo componente o cualquier combinación de estos obtenidos mediante la mezcla de componentes individuales.

17. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de la reivindicación 16, que se usa para el cultivo de levaduras, células 30 vegetales o células animales.

18. El medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, en donde el líquido de la etapa (d) es agua, el agua que tiene incorporada en ella uno o más ingredientes seleccionados de aminoácidos y 35 vitaminas.

19. Un método para reconstituir un medio nutritivo, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador en polvo aglomerado en lecho fluidizado o combinación de estos de cualquier reivindicación precedente, en donde el método comprende la reconstitución de un medio, suplemento del medio, subgrupo del medio o combinación 40 de estos con un disolvente.

20. El método de la reivindicación 19, en donde el medio, suplemento del medio, subgrupo del medio o amortiguador o combinación de estos comprende:

(i) una o más sales amortiguadoras; y (ii) un ácido o base.