Anticuerpos para inhibir la coagulación de la sangre y métodos de utilización de los mismos.

Anticuerpo o fragmento del mismo que se une a factor tisular ("TF") humano,

en el que el anticuerpo o fragmento comprende:

(i) regiones hipervariables de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3, en las que:

CDR1 comprende la secuencia de SEC ID NO: 5;

CDR2 comprende la secuencia de SEC ID NO: 6; y

CDR3 comprende la secuencia de SEC ID NO: 7; y

(ii) regiones hipervariables de cadena pesada

CDR1, CDR2 y CDR3, en las que: CDR1 comprende la secuencia de SEC ID NO: 8;

CDR2 comprende la secuencia de SEC ID NO: 9; y

CDR3 comprende la secuencia de SEC ID NO: 10.

Anticuerpos para inhibir la coagulación de la sangre y métodos de utilización de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos y métodos de utilización de los anticuerpos para inhibir la coagulación de la sangre. En particular, la presente invención se refiere a nuevos anticuerpos que se unen específicamente al factor tisular humano nativo con elevada afinidad. Los anticuerpos de la invención son útiles para una serie de aplicaciones, particularmente para reducir la coagulación de la sangre in vivo.

2. Antecedentes

La coagulación de la sangre ayuda a la homeostasis minimizando la pérdida de sangre. En general, la coagulación de la sangre requiere un daño en los vasos, la agregación plaquetaria, factores de coagulación y la inhibición de fibrinólisis. Los factores de coagulación actúan a través de una cascada que relaciona el daño en los vasos con la formación de un coágulo de sangre (véase en general L. Str y er, Biochemistr y , 3rd Ed, W.H. Freeman Co., New York; and A.G. Gilman et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Edition, McGraw Hill Inc., New York, pág. 1311-1331) .

Existe un acuerdo general de que la activación del factor X en el factor Xa (FXa) es una etapa crítica en el proceso de coagulación de la sangre. En general, FX se convierte en FXa mediante la unión de un complejo catalíticamente activo que incluye "factor tisular" (TF) . TF es una proteína de membrana celular expresada de forma controlada que se une al factor VII/VIIa para producir el complejo catalíticamente activo (TF:VIIa) . El coágulo de sangre sigue a la activación mediada por FXa de la protrombina. La coagulación de la sangre se puede minimizar mediante la inactivación de TF en las formas no nativas que no puede producir de manera óptima el complejo TF:VIIa. La formación excesiva de FXa se cree que contribuye a varias trombosis, incluyendo reestenosis.

La trombosis puede estar asociada con procedimientos médicos invasivos, tales como cirugía cardiaca (por ejemplo, angioplastia) , cirugía abdominotorácica, cirugía arterial, despliegue de dispositivos (por ejemplo, un stent o catéter) , o endarterectomía. Además, la trombosis puede estar acompañada de varios trastornos tromboembólicos y coagulopatías, tales como embolia pulmonar (por ejemplo, fibrilación atrial con embolización) y coagulación intravascular diseminada, respectivamente. La manipulación de fluidos corporales también puede dar lugar a trombos no deseados, particularmente en transfusiones de sangre o muestreo de fluidos, así como procedimientos que implican la circulación extracorpórea (por ejemplo, cirugía cardiopulmonar con bypass) y diálisis.

Los anticoagulantes se utilizan a menudo para aliviar o evitar coágulos de sangre asociados con trombosis. La coagulación de sangre se puede minimizar o eliminar a menudo mediante la administración de un anticoagulante adecuado o una mezcla de los mismos, incluyendo uno o más de un derivado de cumarina (por ejemplo, warfarina y dicumarol) o un polímero cargado (por ejemplo, heparina, hirudina o Bivalirrudina) . Véase, por ejemplo, Gilman et al., supra, R.J. Beigering et al., Ann. Hemathol., 72:177 (1996) ; J.D. Willerson, Circulation, 94:866 (1996) .

Sin embargo, la utilización de anticoagulantes están asociada a menudo con efectos secundarios, tales como hemorragia, reoclusión, síndrome de "coágulo blanco", irritación, defectos en el parto, trombocitopenia y disfunción hepática. La administración a largo plazo de anticoagulantes puede incrementar particularmente el riesgo de enfermedades mortales (véase, por ejemplo, Gilman et al., supra) .

Ciertos anticuerpos con actividad antiplaquetaria también se han utilizado para aliviar varias trombosis. Por ejemplo, Abciximab es un anticuerpo terapéutico que se administra habitualmente para aliviar varios trastornos tromboembólicos, tales como aquellos que aparecen de la angioplastia, infarto de miocardio, angina inestable y estenosis de arteria coronaria. Adicionalmente, se puede utilizar Abciximab como agente profiláctico para reducir el riesgo de infarto de miocardio y angina (J.T. Willerson, Circulation, 94:866 (1996) ; M.L. Simmons et al., Circulation, 89:596 (1994) ) .

También se conocen ciertos anticuerpos anticoagulantes. Particularmente, se ha descrito que ciertos anticuerpos de unión a TF inhiben la coagulación de la sangre, presumiblemente interfiriendo con el ensamblaje de un complejo TF:VIIa catalíticamente activo (véase por ejemplo, Jeske et al., SEM in THROM. and HEMO, 22:213 (1996) ; Ragni et al., Circulation, 93:1913 (1996) ; Patente Europea No. 0 420 937 B1; W. Rufet al., Throm. Haemosp., 66:529 (1991) ; M.M. Fiorie et al., Blood, 8:3127 (1992) ) .

Sin embargo, los actuales anticuerpos de unión a TF muestran desventajas significativas que pueden minimizar su idoneidad como anticoagulantes. Por ejemplo, los actuales anticuerpos de unión a TF no muestran una suficiente afinidad de unión para la actividad anticoagulante óptima. Por consiguiente, para muchas patologías trombóticas, para compensar dichas afinidades de unión inefectivas, se deben administrar niveles de anticuerpo inaceptablemente elevadas para minimizar la coagulación de la sangre. Además, los actuales anticuerpos de unión a TF no discriminan de manera eficaz entre TF nativo y formas no nativas de TF, es decir, los anticuerpos actuales no muestran una especificidad de unión suficiente. Además, los actuales anticuerpos de unión a TF no evitan que FX se una a TF y/o el complejo TF:VIIa.

De este modo, sería deseable tener un anticuerpo anticoagulante que se una a TF humano nativo con una afinidad y selectividad elevadas para inhibir así la coagulación indeseada de sangre y la formación de coágulos de sangre. Sería también deseable tener dicho anticuerpo anticoagulante que evite la unión del Factor X al complejo TF/VIIa.

Fiore M. M. et al, Blood, vol. 80, no. 12 (15 de diciembre) , 1992; páginas 3127-3134 describe dos anticuerpos monoclonales anti-TF (TF8-11D12 y TF9-9C3) . WO 94/05328 se refiere a moléculas que se unen al factor tisular y alteran el complejo TF:VIIa. WO 96/40921 proporciona anticuerpos injertados en CDR contra factor tisular humano que mantiene la afinidad de unión elevada de anticuerpos monoclonales de roedor contra factor tisular, pero tienen una inmunogenicidad reducida. WO 89/12463 se refiere a un método y composición terapéutica para el tratamiento del infarto de miocardio que comprende la administración de un antagonista de proteína de factor tisular y un agente trombolítico. US 5 437 864 proporciona un método de inhibición de la coagulación den circulación extracorpórea en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal que inhibe la capacidad del factor tisular de unirse al factor VII/VIIa.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

Se han descubierto anticuerpos que proporcionan una actividad anticoagulante superior mediante la unión de un TF humano nativo con una afinidad y especificidad elevadas. De este modo, en un aspecto, la presente invención proporciona la reivindicación 1. Los anticuerpos de la invención pueden inhibir de manera eficaz la coagulación de la sangre in vivo. Los anticuerpos de la invención se pueden unir a TF humano nativo, ya sea solo o presente en un complejo TF:VIIa, evitando de manera efectiva la unión del factor X a TF o ese complejo, y reduciendo así la coagulación de la sangre.

Los anticuerpos preferidos de la invención con monoclonales y unen específicamente y une un epítopo conformacional predominante a TF humano nativo, cuyo epítopo proporciona un sitio de unión a anticuerpo inesperadamente fuerte. De hecho, los anticuerpos preferidos de la invención se unen a TF humano nativo por lo menos aproximadamente 5 veces más, más habitualmente por lo menos aproximadamente diez veces más que la afinidad de unión mostrada por anticuerpos anticoagulantes anteriores. Adicionalmente, los anticuerpos preferidos de la invención son selectivos para TF humano nativo y no se unen sustancialmente a TF no nativo o desnaturalizado. H36.D2.B7 (secretado por el hibridoma ATCC HB-12255) es un anticuerpo especialmente preferido de la invención.

Los anticuerpos preferidos de la invención se unen a TF, de manera que FX no se une de manera efectiva al complejo TF/factor VIIa, por lo cual FX no se convierte de manera efectiva en su forma activada (FXa) . Los anticuerpos preferidos... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo o fragmento del mismo que se une a factor tisular ("TF") humano, en el que el anticuerpo o fragmento comprende:

(i) regiones hipervariables de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3, en las que: CDR1 comprende la secuencia de SEC ID NO: 5; CDR2 comprende la secuencia de SEC ID NO: 6; y CDR3 comprende la secuencia de SEC ID NO: 7; y

(ii) regiones hipervariables de cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3, en las que: CDR1 comprende la secuencia de SEC ID NO: 8; CDR2 comprende la secuencia de SEC ID NO: 9; y CDR3 comprende la secuencia de SEC ID NO: 10.

2. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo monoclonal.

3. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo quimérico.

4. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo humanizado.

5. Anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena ligera que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 y/o una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4.

6. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 y/o una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4.

7. Anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento comprende una región constante humana.

8. Anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo de cadena sencilla.

9. Anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la afinidad de unión del anticuerpo o fragmento para un TF humano es igual o superior a la del anticuerpo monoclonal H36.D2.B7 que es producido por el hibridoma que se deposita con la ATCC bajo el número de acceso HB-12255.

10. Anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo o fragmento tiene una constante de asociación para TF humano de por lo menos aproximadamente 1 x 1010 M-1.

11. Anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la afinidad de unión del anticuerpo o fragmento para un TF humano sobre TF humano desnaturalizado es igual o superior a la del anticuerpo monoclonal H36.D2.B7 que es producido por el hibridoma que se deposita con la ATCC bajo el número de acceso HB-12255.

12. Anticuerpo que se une a factor tisular ("TF") humano, en el que el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal H36.D2.B7 que es producido por el hibridoma que se deposita con la ATCC bajo el número de acceso HB-12255.

13. Anticuerpo humanizado que se une a factor tisular ("TF") humano, en el que el anticuerpo es un derivado humanizado del anticuerpo según la reivindicación 12.

14. Método de purificación de factor tisular ("TF") humano a partir de una muestra biológica, comprendiendo el método poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Método para detectar factor tisular ("TF") humano en una muestra biológica, comprendiendo el método poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

16. Anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para utilizar en la inhibición de la coagulación de la sangre en un mamífero.

17. Utilización de un anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para la fabricación de un medicamento para inhibir la coagulación de la sangre en un mamífero.

18. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 16, o utilización según la reivindicación 17, en que el mamífero padece o es sospechoso de tener una trombosis, o el mamífero padece o es susceptible a una reestenosis asociada con un procedimiento médico invasivo, o el mamífero padece una patología tromboembólica asociada con una enfermedad cardiovascular, una enfermedad infecciosa, una enfermedad neoplásica, o utilización de un agente trombolítico.

19. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 16, o utilización según la reivindicación 17, en que el mamífero es un humano.

20. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 16, o utilización según la reivindicación 17, en que el anticuerpo se administra combinado con una composición antiplaquetaria, una composición trombolítica o una composición anticoagulante.

21. Anticuerpo o fragmento según la reivindicación 16, o utilización según la reivindicación 17, en que el anticuerpo se administra combinado con heparina, hirudina, Bivalirudina, Abciximab, activador de plasminógeno de tejido, estreptoquinasa, o uroquinasa.

22. Anticuerpo o fragmento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para utilizar como medicamento.

23. Ícido nucleico aislado que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a factor tisular ("TF") humano, en el que:

(a) el ácido nucleico codifica una región variable de cadena ligera y comprende las secuencias de polinucleótidos de SEC ID NOs: 11, 12, y 13; y (b) el ácido nucleico codifica una región variable de cadena pesada y comprende las secuencias de polinucleótidos de SEC ID NOs: 14, 15, y 16.

24. Ícido nucleico aislado según la reivindicación 23, que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEC ID NO: 1 y la secuencia de polinucleótidos de SEC ID NO: 3.

25. Ícido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

26. Vector que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25.

27. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 26.

28. Célula huésped que comprende (a) un primer vector que comprende un ácido nucleico, en el que el ácido nucleico codifica una región variable de cadena ligera de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a factor tisular ("TF") humano y comprende las secuencias de polinucleótidos de SEC ID NOs: 11, 12, y 13; y (b) un segundo vector que comprende un ácido nucleico, en el que el ácido nucleico codifica una región variable de cadena pesada de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a factor tisular ("TF") humano y comprende las secuencias de polinucleótidos de SEC ID NOs: 14, 15, y 16.

REGIÓN VARIABLE DE CADENA LIGERA ANTI-FACTOR TISULAR